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背景：系膜增殖性肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)是我国发病率最高的肾脏疾病之一。其主要的病理变化是弥漫性肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增生,以及不同程度的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增多。同时,MsPGN是导致慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的首要原因,可引起大量蛋白尿、高血压肾损害等一系列并发症,如果病情继续进展恶化,还可引起肾小球硬化及肾间质纤维化,最终成为导致终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的主要病因。抑制系膜细胞增殖是治疗系膜增殖性肾小球疾病重要的治疗策略。近年来生命科学研究领域的一个重大突破就是在真核生物体内发现了具有调节功能的非编码RNA——microRNA (miRNA)。这些小RNA广泛参与调控生物增殖／凋亡、发育/衰老等病理生理过程,与人类疾病的发生发展密切相关。目前研究表明,miR-34a可能参与调控多个信号通路而影响细胞的增殖。RNA干扰(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA (dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉寂,可以迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉默中起中心作用,可对特定信使RNA (mRNA)进行特异性的降解。siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的元件。siRNA与miRNA具有众多相似性,所以利用siRNA模拟miRNA实验以证明miRNA对于靶基因作用的特异性。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)是细胞培养中最常用的营养物质,其中含有几十种蛋白质、微量元素、生长因子等。在培养细胞时通常采用10%-15%FBS进行,实验中我们可以利用高浓度(20%)FBS培养细胞,以刺激细胞进行过度增殖,与以往单一利用某种刺激因子比较,高浓度FBS更能模拟生物体内病理情况复杂的环境。如果我们可以利用miR-34a可以拮抗这一现象,可以推测其在体内也可以有相似作用。目的：制备抗Thyl抗体并制备抗Thyl系膜增殖性肾炎大鼠模型。观察miR-34a在各病理时间点变化趋势。之后,利用siPDGFR-β证明miR-34a对于已经证明的靶基因PDGFR-β及Ras/MAPK信号通路的调控作用,并在体外证实miR-34a可以拮抗外源性刺激引起的细胞过度增殖现象。方法：1.利用OX-7杂交瘤细胞株产生抗Thy1抗体,纯化后经尾静脉注射Wistar大鼠建立抗Thyl系膜增殖性肾炎大鼠模型。检测不同病理时间点(第0、3、5、7、10、14天)肾功能和24小时尿蛋白定量；2.利用免疫组化方法,检测各病理时间点Ki67及细胞周期蛋白cyclin D1的表达变化趋势；3.留取各病理时间点肾脏组织并提取肾小球,Western Blot检测G0/G1期细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、p27kip1表达变化趋势；4.利用TaqMan Real-time PCR检测各病理时间点miR-34a表达的变化趋势；5.将siPDGFR-β或siRNA negative control转染大鼠系膜细胞系(RMC),利用Cell Counting Kit-8方法检测不同时间点(24h,48h,72h)各组细胞增殖速率的变化程度；6.将siPDGFR-β或siRNA negative control转染大鼠系膜细胞系(RMC)48h后,利用流式细胞仪检测RMC细胞周期变化；7.将siPDGFR-β或siRNA negative control转染大鼠系膜细胞系(RMC)48h后,检测靶基因PDGFR-β. Ras/MAPK信号通路的各个靶点K-ras、Rafl、 p-Rafl、MEK1、p-MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2及细胞周期相关蛋白cyclin D1、 cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、p27kip1的蛋白表达变化趋势；8.利用双荧光素酶报告质粒系统检测miR-34a对可能靶基因CDK2、cyclin E表达的调控作用；9.利用高浓度胎牛血清(20%FBS)刺激转染miR-34a mimics的大鼠系膜细胞,利用Cell Counting Kit-8方法检测不同时间点(24h,48h,72h)各组细胞增殖速率的变化程度；10.利用高浓度胎牛血清(20%FBS)刺激转染miR-34a mimics的大鼠系膜细胞,利用流式细胞仪检测RMC细胞周期变化；11.利用高浓度胎牛血清(20%FBS)刺激转染miR-34a mimics的大鼠系膜细胞,检测靶基因PDGFR-β、Ras/MAPK信号通路的各个靶点K-ras、Raf1、p-Raf1、 MEK1、p-MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2及细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、p27kipl的蛋白表达变化趋势。结果：1.成功制备抗Thy1抗体,并利用该抗体制备了抗Thyl系膜增殖性肾炎大鼠模型。与对照组相比,病理组大鼠第5天和第7天24h尿蛋白定量显著升高(p<0.05),第10天后24h尿蛋白定量开始下降。2.各病理时间点Ki67表达随病理变化成正关系。与对照组相比,病理组第7天Ki67表达量显著增加(p<0.05),并随病理转归而下降。细胞周期蛋白cyclinD1的表达与Ki67趋势相同,在病理最终的第7天表达量最高(p<0.05),随病理转归而回到正常。3. Western Blot检测各病理组细胞周期相关蛋白表达。结果表明,与对照组相比,病理组第7天,cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6的表达最高(p<0.05),而p27kiP1表大量最低(P<0.05)。4. TaqMan Real-time PCR检测各病理组mIR-34a表达量变化,结果表明,与对照组相比,miR-34a表达与病理变化成负相关,病理组第7天表达量最低(p<0.05),随病理转归回到正常。5.用siPDGFR-β或siRNA negative control转染大鼠系膜细胞系(RMC)。与对照组相比,siPDGFR-β组增殖活性从48h开始明显下降(p<0.05),至72h更加明显(p<0.05)。同时通过流式细胞技术检测细胞周期变化,siPDGFR-β组细胞周期主要是阻滞在G0/G1期(p<0.05)(使得G0/G1期延长)；6.用siPDGFR-β或siRNA negative control转染大鼠系膜细胞系(RMC),Western Blot检测对PDGFR-β与p-PDGFR-β的影响。与对照组相比,siPR-β处理组的PDGFR-β、p-PDGFR-β蛋白表达量明显下降(p<0.05)。7.利用siPDGFR-β或siCON转染RMCs,检测其对RAS/MAPK信号通路关键靶点的改变。结果表明,与对照组相比,K-Ras的总蛋白水平下调(p<0.05),Rafl、MEK1、ERK1/2的总蛋白水平不变(p>0.05)。p-Rafl、p-MEK1、 p-ERK1/2蛋白水平下调(p<0.05)；8.利用siPDGFR-β或siCON转染RMC后,检测其对细胞周期蛋白cyclin D1、 cyclin E, CDK蛋白CDK2、CDK4、CDK6, CKI蛋白,p27kiPl的蛋白影响。结果表明,siPDGFR-β可以下调cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6的蛋白水平(p<0.05),p27kip1表达量明显上调(p<0.05)；9.为验证CDK2或cyclin E是否为miR-34a的靶基因,我们将CDK2/cyclin E mRNA的3’UTR序列克隆至双荧光素酶报告载体质粒psiCHECKTM-2上。结果显示,miR-34a mimics可以下调RMC细胞psiCHECK-CDK2/cyclin E的荧光素酶活性(p<0.05)；10.利用miR-34a mimics或者niRNA negative control转染细胞后,并用20%FBS血清刺激细胞。结果表明,从48小时开始,20%FBS组与20%FBS+Con组增殖能力高于10%FBS组及20%FBS+miR34a组(p<0.05),但是10%FBS与20%FBS+miR34a组无差别(p>0.05)；11.利用niR-34a mimics或者miRNA negative control转染细胞后,并用20%FBS血清刺激细胞。结果表明,在48小时开始,20%FBS+Con组的细胞周期G0/G1期与10%FBS组相比明显缩短(p<0.05),而20%FBS+miR34a组的G0/G1期与20%FBS+Con相比明显延长(p<0.05)。每次检测的CV(%)均小于10%,表明结果可信；12.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control转染细胞后,并用20%FBS血清刺激细胞。结果表明,在刺激48小时后,与10%FBS组与20%FBS+miR34a组相比,20%FBS+Con组PDGFR-β与p-PDGFR-β的蛋白表达明显增高(p<0.05),20%FBS+miR34a组与10%组无差别(p>0.05)；13.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control转染细胞后,并用20%FBS血清刺激细胞。结果表明,在刺激48小时后,与10%FBS组与20%FBS+miR34a组相比,20%FBS+Con组的Raf1、ERK1/2的总蛋白无明显差异((P>0.05), K-Ras的总蛋白水平上调(p<0.05)。p-Raf1、p-MEK1、 p-ERK1/2蛋白水平上调(p<0.05)。与20%FBS+Con组相比,20%FBS+miR34a组的MEK1蛋白明显降低(p<0.05)；14.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control转染细胞后,并用20%FBS血清刺激细胞。我们检测其对细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E, CDK蛋白CDK2、CDK4、CDK6, CKI蛋白,p27kiP;的蛋白影响。结果表明,与20%FBS+miR34组相比,20%FBS+Con组的cyclin D1, cyclin E, CDK2,CDK4, CDK6的蛋白水平明显上调(p<0.05), p27kip1表达量明显下调p<0.05)。结论：1.在抗Thy1系膜增殖性肾炎大鼠模型中,miR-34a随着病理变化而变化,呈负相关；2. miR-34a可以通过直接作用于靶基因PDGFR-β,进而作用于Ras/MAPK信号通路活性,影响细胞周期G0/G1期,从而抑制系膜细胞增殖；3. siPDGFR-β可以通过抑制PDGFR-β而作用于Ras/MAPK信号通路,延长G0/G1期,从而使RMC细胞增殖活性下降,此结果有力证实miR-34a是通过作用于靶基因PDGFR-β从而影响大鼠系膜细胞增殖；4.miR-34a可以拮抗外源性刺激引起的细胞过度增殖现象。