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本文研究红色非硫磺菌(混菌)和沼泽红假单胞菌在累积聚β-羟基丁酸(PHB)作为生产可降解塑料主要原料方面的应用。研究从以下七个方面着手:1、确定实验室培养红色非硫磺混合菌以及沼泽红假单胞菌的具体培养条件;2、实验室条件下对红色非硫磺混合菌以及沼泽红假单胞菌进行扩大培养;3、菌体胞内累积物的确定和菌体内累积PHB的验证;4、PHB标准物的定性定量分析及菌体内累积的验证;5、酯化方法的改良;6、红色非硫磺混合菌以及沼泽红假单胞菌累积PHB最佳条件的确定; 7、胞内累积PHB的尝试提取。
研究结果表明:
1、实验室条件下红色非硫磺混合菌的最佳生长条件为以2-4g/L无水乙酸钠为碳源,1.5g/L硫酸铵为氮源,生长因子添加量为1.5mL/L,微量元素液的添加量为1.5mL/L,培养基调节pH为中性(培养基采用光合细菌通用培养基),接种量为50%,于日光灯下室温约30℃进行光照厌氧培养;沼泽红假单胞菌的最佳生长条件为以2-4g/L无水乙酸钠为碳源,1.5g/L氯化铵为氮源,生长因子添加量为1.5mL/L,微量元素液的添加量为1.5mL/L,培养基调节pH为中性(7.0左右),接种量为50%,于日光灯下室温30℃进行光照厌氧培养。
2、在扩大培养的基础上对两种菌体内是否能够累积PHB进行初步确定,通过普通光学显微镜放大1000倍可以观察到两种菌体内都有疑似PHB的白色脂粒点,通过送样至上海交通大学医学院(原上海第二医科大学)电镜分析中心和同济大学生命科学与技术学院电镜分析中心进行切片分析,能清楚的看到菌体内的PHB脂粒。
3、通过方法筛选最后确定采用高效气相色谱法(GC)对标准PHB进行分析,并使用气-质连用(GC-MS)对定性结果进行确认,酯化后产物β-羟基丁酸甲酯在本试验条件下气相色谱保留时间为6.7min;通过对两种菌液进行气相色谱分析进一步确定了菌体对PHB的累积。
4、酯化的方法基本按照Sophie Jan等的气相色谱法进行分析,取2mL菌液直接进行酯化,改良之处为硫酸甲醇体积比为1: 1,菌体酯化形式可在洗涤离心后直接进行酯化,内标物苯甲酸甲酯用量为100μL/2mL,容器选用螺口密封瓶。
5、两种菌在现有的碳源、氮源的基础上都可以保证良好的生长和对PHB的累积,在保证生长的基础上适当的增加碳氮比可增加累积量,碳源氮源的追加对菌体累积量的影响不是很大,适当的增加或者是追加镁离子的含量会使菌体累积PHB的量有所提高,初始培养基中性或者是略为偏碱都有利于PHB的累积。
6、在试验的基础上,粗略计算得出PHB的累积量最大约为50%,虽然没有达到有关文献报道的最高值70%,但是累积量仍然比较大,所以提取的可行性很大,由于试验条件的限制目前只是确定了提取的可行方法。
7、酯化方法的再改良:将Sophie Jan等的气相色谱法改进后在本试验中的可行性提高了很多,但还存在一些问题如温度、催化剂、容器等,再改良采用降低酯化温度的同时增加催化剂(硫酸)浓度的方法,经过GC检验后发现,在此条件下虽然对PHB的定性并没有很大的影响,副产物却相对增多,在试验室中可行,却不适合大规模工程实际应用。