肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,除了血道转移之外,淋巴道转移是其重要转移途径,而这一过程是多因素多步骤、多阶段的复杂调控过程。将一系列功能结构密切相关、在通路途经上紧密联系的相关分子,如肿瘤细胞-淋巴管内皮细胞相关分子作为一个整体进行观察,将是今后包括肝癌在内的诸多肿瘤发生、发展、淋巴道转移预测及临床评估的重要研究方向。如今,肿瘤诱导的淋巴管生成已成为肿瘤转移领域中的研究热点。越来越多的证据提示,新生的淋巴管不仅存在于肿瘤周边,还可出现在肿瘤内部,不仅可作为判断肿瘤淋巴结转移的前兆指标,也可能成为预防淋巴道转移的治疗靶点。近年来,随着淋巴管内皮细胞(LEC)淋巴管相关分子的发现,如CNTN1、Prox-1、Podoplanin、LYVE-1、SOX18等作为VEGF-C/D-VEGFR-3/NRP-2轴的直接参与者,被激活后会诱导淋巴管内皮细胞增生、分化、成熟、构建或重塑新生和原有淋巴管结构,同时促进肿瘤细胞向淋巴道的趋化、游走、侵袭和转移。本课题组前期研究已经从高低不同淋巴道转移能力肝癌细胞株Hca-F和Hca-P中筛选出差异表达基因Annnexin A7(ANXA7)和VEGF-C,并发现这两个基因的表达可能与肿瘤淋巴道转移密切相关。因此,研究肿瘤细胞与肿瘤淋巴管内皮细胞的相互作用,了解VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子怎样形成网络相互协同参与肿瘤的发生发展过程,特别是探究体内外高低不同淋巴道转移潜能肝癌细胞中ANXA7基因表达调控对淋巴管内皮细胞(LEC)中的VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2轴及相关分子表达的影响,对于阐明肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移分子生物学机制具有重要的理论和临床病理意义。目的:1.通过体外实验Hca-F/Hca-P肝癌细胞(简称F/P)及其ANXA7沉默和过表达细胞分别与LEC共培养,观察比较不同共培养LEC即L-F共、L-P共、L-FA7下调共、L-FSH无关序列共;L-PA7上调共、L-PNC空载体共细胞中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子CNTN1、Prox-1、SOX18、Podoplanin、LYVE-1的表达,进一步揭示不同淋巴道转移能力的肝癌细胞F/P及其ANXA7调控对与之共培养的LEC中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子表达和淋巴管成形的影响。2.通过体内实验检测Hca-F/P、FA7下调、FSH无关序列和PA7上调、PNC空载体不同肿瘤细胞小鼠体内移植瘤及淋巴结转移灶,即L-F、L-P、L-FA7下调、L-FSH无关序列、L-PA7上调、L-PNC空载体中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子的表达,特别是观察淋巴管生成的情况;比较6组肿瘤细胞F、P;FA7下调、FSH无关序列和PA7上调、PNC空载体在动物体内的移植瘤成瘤率和淋巴结转移率,进一步揭示Hca-F/P细胞及其ANXA7调控对体内移植瘤和淋巴结转移灶中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子表达及对成瘤率和转移率,特别是对淋巴管生成情况的影响。方法:1.Hca-F/P细胞ANXA7沉默和过表达稳定细胞株的建立和扩增,F/P及慢病毒稳定转染的FA7下调、FSH无关序列及PA7上调、PNC空载体细胞与LEC分别共培养.2.q RT-PCR、Western Blot、细胞免疫荧光化学方法分别检测LEC和不同共培养的LEC即L-F共、L-P共;L-FA7下调共、L-FSH无关序列共;L-PA7上调共、L-PNC空载体共细胞中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子CNTN1、Prox-1、SOX18、Podoplanin、LYVE-1在m RNA、蛋白质水平的表达。3.ELISA检测L-F共、L-P共、LEC;L-FA7下调共、L-FSH无关序列共;L-PA7上调共、L-PNC空载体共细胞上清中VEGF-C/D的表达;4.淋巴管成形实验检测上述6组肿瘤细胞对LEC淋巴管成形能力的影响。5.建立Hca-F/P、稳定转染FA7下调、FSH无关序列和PA7上调、PNC空载体细胞肿瘤淋巴道转移动物模型,每组8只。分别在肿瘤注射第7、14、21、28天,利用小动物成像系统、肉眼观察及HE染色检测以上6组肿瘤细胞小鼠体内的移植瘤成瘤和淋巴结转移情况;第28天以取眼球球后动脉血的方式处死小鼠,留取血清和相应肿瘤及淋巴结组织。6.q RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色、EALISA方法在m RNA、蛋白质水平观察VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子在小鼠移植瘤淋巴结转移灶、正常淋巴结及小鼠血清中的表达;7.淋巴管特异性分子LYVE-1和Podoplanin标记法结合Image J软件,分析小鼠移植瘤及淋巴结转移灶中微淋巴管密度、分布部位、管腔面积及标记物表达强度。结果:一.体外Hca-F/P细胞对共培养LEC中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子表达的影响1.m RNA、蛋白质水平,配体VEGF-C/D、受体NRP-2/VEGFR-3及淋巴管相关分子SOX18、Podoplanin、LYVE-1在L-F共、L-P共细胞中表达均高于LEC,且以Podoplanin、LYVE-1更为明显;而CNTN1、Prox-1在L-F共、L-P共细胞中表达均低于LEC,以CNTN1在二者间差异较大;在L-F共、L-P共、LEC细胞中VEGF-C表达略低于VEGF-D;NRP-2表达略高于VEGFR-3;在L-F共细胞中VEGF-C/D,NRP-2/VEGFR-3及淋巴管相关分子Podoplanin、LYVE-1、SOX18表达高于L-P共;在L-F共细胞中CNTN1、Prox-1表达低于L-P共,各组细胞均以Podoplanin、LYVE-1和CNTN1变化幅度较显著。2.L-F共、L-P共共培养及LEC细胞上清中VEGF-C表达明显高于VEGF-D,且在L-F共细胞中二者表达差异最大,LEC中差异最小。3.淋巴管成形实验结果显示F细胞共培养促进淋巴管形成的数量多于P细胞;F细胞共培养组LEC管腔周径总长度大于P细胞共培养组,且大于正常LEC组。4.细胞免疫荧光化学结果显示LEC细胞配体VEGF-C/D主要定位于细胞浆;受体VEGFR-3/NRP-2主要定位于细胞膜,少量于细胞浆;相关分子CNTN1、Podoplanin、LYVE-1主要定位于细胞浆,Prox-1、SOX18主要定位于细胞核,少量于细胞浆中。二.体外Hca-F/P细胞ANXA7沉默和过表达对共培养LEC中VEGF-C/D-VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子表达的影响1.慢病毒稳定转染的FA7下调、FSH无关序列及PA7上调、PNC空载体细胞系成功构建并稳定传代,转染效率均大于90%,ANXA7基因在F、P细胞中成功沉默和过表达。2.m RNA、蛋白质水平显示肿瘤细胞F/P中ANXA7表达调控后,与之共培养的LEC即L-FA7下调共、L-PA7上调共中配体VEGF-C/D、受体VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子SOX18、Podoplanin、LYVE-1表达与ANXA7沉默或过表达变化方向一致,即ANXA7沉默时上述分子表达均降低,ANXA7过表达时则升高;而CNTN1、Prox-1则与ANXA7沉默或过表达变化方向相反,即ANXA7沉默时这两个分子表达均升高,ANXA7过表达时则降低,其中Podoplanin、LYVE-1和CNTN1受ANXA7调控影响较大;ANXA7表达调控后L-FA7下调共、L-PA7上调共细胞与相应对照组L-FSH无关序列共和L-PNC空载体共细胞相比,VEGF-C表达降低或升高幅度大于VEGF-D;VEGFR-3表达降低或升高幅度大于NRP-2。3.在四组共培养细胞L-FSH无关序列共,L-PNC空载体共,L-FA7下调共,L-PA7上调共上清中VEGF-C表达均高于VEGF-D,且随着ANXA7的调控,VEGF-C/D表现出与ANXA7一致的降低或升高趋势,且以VEGF-C变化最为明显。4.淋巴管成形实验结果显示PA7上调细胞促进LEC形成淋巴管的数量多于PNC空载体细胞,且与ANXA7过表达或沉默变化方向一致,即ANXA7沉默表达时淋巴管内皮细胞L-FA7下调共与对照组L-FSH无关序列相比淋巴管成形数量减少,且管腔周径总长度降低,ANXA7过表达时则成形数量增多,总长度增加。三.Hca-F/P细胞体内移植瘤淋巴结转移灶VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子的表达1.肿瘤细胞接种后第14天可见足垫F/P移植瘤体积增大,第21天腹股沟处可触及肿大的淋巴结,第28天部分可见包括腹股沟、腘窝、腋窝、腹膜后、髂动脉旁淋巴结增大。2.HE结果显示28天后移植部位F组全部成瘤,成瘤率100%,且6只发生淋巴结转移,转移率75%;P组移植部位6只成瘤,成瘤率75%,2只发生淋巴结转移,转移率33%。3.q RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色、EALISA等检测方法显示在m RNA、蛋白质水平,F/P淋巴结转移灶中VEGF-C/D、VEGFR-3/NRP-2及相关分子Podoplanin、LYVE-1、SOX18表达均高于相应小鼠正常淋巴结,F组VEGF-C/D、VEGFR-3/NRP-2及相关分子Podoplanin、LYVE-1、SOX18表达均高于P组;而CNTN1、Prox-1在F/P组表达均低于相应小鼠正常淋巴结;在F组表达均低于P组;Podoplanin、LYVE-1、CNTN1表达变化最为明显;淋巴结转移灶中VEGF-C表达均低于VEGF-D;受体NRP-2均高于VEGFR-3。4.在荷瘤小鼠动物血清中,VEGF-C/D在F/P组表达高于相应正常小鼠组;在F组表达高于P组,且VEGF-C表达均高于VEGF-D。5.淋巴管特异性标记物检测显示,F移植瘤及淋巴结转移灶L-F中微淋巴管数量和面积明显高于相应P细胞移植瘤及淋巴结转移灶L-P;同时表现出肿瘤周边的淋巴管增多较明显。四.Hca-F/P细胞ANXA7调控对小鼠体内移植瘤淋巴结转移灶VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子表达的影响1.小动物活体成像系统在肿瘤接种后第14天观察可见移植部位肿瘤细胞标记的绿色荧光,证实移植肿瘤形成;第21天可见腹股沟等处肿瘤细胞标记的绿色荧光,证实已发生淋巴结转移。2.HE结果显示FA7下调组6只成瘤,成瘤率75%,3只发生淋巴结转移,转移率50%;FSH无关序列组8只成瘤,成瘤率100%,6只发生转移,转移率75%;PA7上调组8只成瘤,成瘤率100%,5只发生淋巴结转移,转移率62.5%;PNC空载体组6只成瘤,成瘤率75%,其中2只发生淋巴结转移,转移率33.3%,与小动物活体成像的观察结果一致。3.q RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色、EALISA等检测方法显示在m RNA、蛋白质水平,FA7下调、PA7上调、FSH无关序列、PNC空载体四组小鼠移植瘤淋巴结转移灶中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子Podoplanin、LYVE-1、SOX18的表达与ANXA7沉默或过表达变化方向一致,即ANXA7沉默时上述分子表达均降低,ANXA7过表达时则升高;而CNTN1、Prox-1与ANXA7沉默或过表达变化方向相反,即ANXA7沉默时上述分子表达均升高,ANXA7过表达时则降低,且Podoplanin、LYVE-1、CNTN1受ANXA7调控影响较大。VEGF-C表达均低于VEGF-D;NRP-2表达高于VEGFR-3;ANXA7表达调控后FA7下调、PA7上调细胞移植瘤淋巴结转移灶中,VEGF-C与ANXA7同向降低或升高的幅度大于VEGF-D;VEGFR-3与ANXA7同向变化幅度大于NRP-2。4.在FA7下调、PA7上调、FSH无关序列、PNC空载体四组荷瘤小鼠血清随着ANXA7的沉默和过表达,VEGF-C/D在小鼠血清中表现出与ANXA7同向一致的变化趋势,即ANXA7沉默时VEGF-C/D表达均降低,ANXA7过表达时则升高;四组小鼠血清中VEGF-C表达变化幅度显著高于VEGF-D。5.淋巴管特异性标记物检测显示,随着ANXA7的调控,FA7下调、PA7上调移植瘤及淋巴结转移灶L-FA7下调、L-PA7上调中微淋巴管数量和面积与相应对照组FSH无关序列、PNC空载体和L-FSH无关序列、L-PNC空载体相比,表现出与ANXA7沉默和过表达一致的变化趋势,即F细胞ANXA7沉默时,FA7下调移植瘤及淋巴结转移灶L-FA7下调中微淋巴管数量和面积减少;P细胞ANXA7过表达时,则PA7上调植瘤及淋巴结转移灶L-PA7上调中微淋巴管数量和面积增多;且以肿瘤周边淋巴管变化比较明显。结论:1.体内外实验结果一致提示,淋巴管内皮细胞中VEGF-C/D—VEGFR-3/NRP-2及淋巴管相关分子Podoplanin、LYVE-1、SOX18表达与淋巴道转移潜能正相关,ANXA7表达对其发挥正调控作用;而CNTN1、Prox-1分子表达与淋巴道转移潜能呈负相关,ANXA7表达对其发挥负调控作用。2.ANXA7表达调控对VEGF-C的影响大于VEGF-D;对VEGFR-3的影响大于NRP-2,且Podoplanin、LYVE-1和CNTN1受ANXA7调控影响较大;VEGF-C、VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、CNTN1与肝癌淋巴道转移关系更加密切,提示这些分子在肝癌淋巴道转移过程中可能发挥主要作用。3.体内外ELISA结果共同显示,VEGF-C/D主要以分泌蛋白的形式在肿瘤淋巴管生成过程中发挥作用,且以VEGF-C作用为主;肝癌细胞F、P与LEC共培养对于VEGF-C/D特别是VEGF-C的分泌均具有促进作用,且高淋巴道转移潜能F细胞作用强于低淋巴道转移潜能P细胞;ANXA7对VEGF-C/D分泌具有正向调控作用,且促进VEGF-C分泌作用强于对VEGF-D的作用。4.体外淋巴管内皮细胞成形实验、体内移植瘤淋巴结转移灶成瘤率和转移率、微淋巴管计量等检测共同提示,高淋巴道转潜能肝癌细胞F对淋巴管成形和生成的促进作用强于低淋巴道转移潜能P细胞;肿瘤细胞ANXA7表达调控与体内外淋巴管成形和生成正相关,在肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移过程中发挥正调控作用。5.综合本研究体内外实验结果我们可以得出结论,在小鼠肝癌中ANXA7可能是VEGF-C/D-VEGFR-3/NRP-2较上游的重要通路分子,且与后者共同调控着更下游的淋巴管相关分子SOX18、Podoplanin、LYVE-1、CNTN1、Prox-1的表达,特别是通过VEGF-C、VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、CNTN1等特异性淋巴管生长因子配体、受体及相关分子系统,在肝癌淋巴管生成及淋巴道转移过程中发挥促进作用。