前言细胞凋亡（apoptosis）是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发，在基因调控下引起细胞主动死亡过程。细胞凋亡严重失衡对机体具有破坏作用。现已证实肿瘤发生、发展与细胞凋亡失衡有关。胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma）发病率占全部恶性肿瘤1％—2％，呈逐渐增加趋势；胰腺癌仍是难以攻克的顽疾，手术切除率24.5％-43.4％，术后5年生存率19.6％-26.1％：除手术治疗外唯一姑息选择大多选择化疗。采用吉西他滨（gemcitabine）和5-FU可适度缓解病情。目前化疗不佳主要原因为胰腺癌对化疗药物产生多药耐药（multiple drug resistance，MDR），即不经药物诱导的固有耐药性。近年研究认为：转录因子NF-κB是新近予以关注的最重要的抗凋亡基因之一，参与肿瘤发生、进展过程，且具有强烈抗凋亡作用。封闭NF-κB活化通常被认为下调一些抗凋亡基因，如Bcl-2、XIAP而促进凋亡。最近研究认为：NF-κB活性升高在胰腺癌细胞多药耐药、浸润、转移、凋亡方面起到关键作用，其高表达是导致胰腺癌细胞产生耐药重要原因之一。Sulfasalazine为一种抑制NF-κB的有效制剂，封闭IKKs活化且临床用于治疗类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，NF-κB抑制剂的使用可消除这种耐药性。5-FU是用于治疗胃肠肿瘤的最有效化疗药物之一，它通过封闭胸苷酸激酶诱导某些敏感癌细胞株凋亡。本研究方向围绕着有效抑制胰腺癌NF-κB活化消除5-FU对胰腺癌细胞多药耐药，探讨5-FU、sulfasalazine联合作用是否有协同促进诱导胰腺癌细胞凋亡、抑制多药耐药基因表达和细胞增殖作用，并为此进行体内、体外条件下的相关的实验研究。目的本研究目的在于通过抑制NF-κB活性消除胰腺癌细胞对5-FU化疗耐药并探讨5-FU和sulfasalazine对胰腺癌细胞株BxPC-3抗增殖作用是否与诱导胰腺癌细胞凋亡有关。我们应用RT-PCR和Western Blot检测NF-κB（P65）、Bcl-2、MDR、cyclinD1 mRNA和蛋白水平的变化，探讨在体内、外条件下sulfasalazine，5-FU单独及联合作用于胰腺癌细胞株BxPC-3及细胞BxPC-3裸鼠异位移植瘤上述凋亡相关基因表达之间关系及相互作用机制，为深入研究胰腺癌凋亡机制、多药耐药及细胞增殖周期内在联系，为克服胰腺癌多药耐药提供一定的实验依据。方法一、细胞培养细胞株BxPC-3用RPMI1640培养液（10％胎牛血清，2.0mmol/L谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/L链霉素）在37℃，5％CO₂条件培养。二、采用四甲基唑蓝（MTT）法检测生长抑制率不同浓度的（12.5，25，50，100mg/L）5-FU、（25，50，100，200 mg/L）sulfasalazine单独及联合作用（终浓度为100+200，100+100，50+200，50+100 mg/L）细胞BxPC-3在不同时间的生长抑制率，并设立各自同期阴性对照组，酶联免疫检测仪在波长570nm测吸收光度值（A值），计算生长抑制率=（阴性对照组A₁值-用药组A值）/（阴性对照组A₁值-空白组A₀值）×100％，上述实验重复3次。三、PI染色法检测细胞BxPC-3中晚期凋亡率及细胞周期的变化不同浓度的（12.5，25，50，100mg/L）5-FU、（25，50，100，200mg/L）sulfasalazine单独及联合作用（终浓度为100+200，100+100，50+200，50+100mg/L）同步化的细胞BxPC-3在不同时间（12，24，36，48h）的中晚期凋亡率及细胞周期变化，设3个阴性对照组（分别为0.09％NaCl，0.2％DMSO，0.09％NaCl+0.2％DMSO），低于G₁期亚二倍体细胞为凋亡细胞，用CELL Quest软件（Becton Dickson，美国）分析样本，测出各细胞周期百分率和凋亡率，并按以下公式计算增殖指数（PI）：PI=（S+G₂/M）/（G₀/G₁+S+G₂/M）。每个样本检测10，000个细胞，上述实验重复6次。四、PI/Annexin-V双染法检测早期凋亡率（100mg/L）5-FU、（200mg/L） sulfasalazine单独及联合作用同步化的胰腺癌细胞株BxPC-3在不同时间（12，24，36，48h）的早期凋亡率，设3个阴性对照组（分别为0.09％NaCl，0.2％DMSO，0.09％NaCl+0.2％DMSO），冷PBS洗涤2次，离心1000rpm 5分钟4℃，弃上清，细胞重悬于200ul binding buffer；加10ulAnnexin V-FITC和5ul PI，轻轻混匀，4℃避光反应30分钟，每个样品加300ulBinding buffer，在1小时内上机检测，上述实验重复6次。五、免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白的表达（100mg/L）5-FU，（200mg/L） sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3 24h时NF-κB（P65），Bcl-2，cyclinD1蛋白表达，并设立各自阴性对照组，95％乙醇固定30min，1％Triton-X-100作用30min，分别与兔抗人NF-κB（P65），Bcl-2，cyclin D1抗体4℃结合24h，与生物素标记山羊抗兔IgG 37℃10min，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水中性树胶封固。根据阳性细胞数和染色强度行半定量分析。六、相差显微镜观察细胞形态变化观察（100mg/L）5-FU，（200mg/L） sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-324h及各自对照组细胞形态变化。七、透射电镜观察细胞内超微结构变化（100mg/L）5-FU，（200mg/L） sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3及各自对照组细胞24h后，PBS洗涤2次，2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，电子染色，透射电镜下观察。八、扫描电镜观察细胞表面的微细结构变化（100mg/L）5-FU，（200mg/L） sulfasalazine单独及联合处理细胞BxPC-3及各自对照组细胞24h后，PBS洗涤2次，2.5％戊二醛前固定，0.3％硝酸银染色20秒，脱水后液态CO₂干燥，喷金包埋。每个样本取8个区域，于10,000x扫描电镜下观察。九、实验裸鼠皮下异位移植瘤模型建立及实验分组BALB/c nu/nu裸小鼠雄：雌性比3:1，鼠龄4-6周，体重（20±2）g，共66只，在SPF条件下饲养。收集体外大量培养细胞株BxPC-3制成浓度为5.0×10⁶个/ml单细胞悬液，在无菌条件下接种于裸小鼠肩胛背部为0.5ml/只，经过2-3个月，待移植瘤直径达到0.6-0.8cm，将移植瘤裸鼠随机分为11组，5-FU、sulfasalazine联合作用组（15+20，15+10，7.5+20，7.5+10mg/kg）、sulfasalazine单独作用组（20，10mg/kg）、5-FU单独作用组（15，7.5mg/kg）及各自阴性对照组分别为controll（NS：DMSO=1:1混合液）、controL2（DMSO）、control3（NS）：按上述方案移植瘤体内注射，隔日1次，治疗共4周，颈椎脱位处死裸鼠，取出肿瘤称重，测量大小，放入EP管中存于-70℃冰箱中备用。十、RT-PCR法检测5-FU、sulfasalazine单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3及皮下异位移植瘤凋亡相关基因（Bcl-2，cyclinD1，Bax及NF-κB（P65））的mRNA水平变化收集移植瘤各处理组、收集各处理组细胞及各自对照组，RNAout提取总RNA，在紫外线分光光度仪测定总RNA含量，取1ul总RNA为模板按照TakaRa公司RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0操作步骤，逆转录合成cDNA，其反应体系为10ul，PCR仪扩增反转录反应产物，反应体系为40ul，结果采用紫外凝胶成像分析系统行目的基因表达水平半定量分析，以上实验重复6次。十一、Western Blot检测检测5-FU、sulfasalazine单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3及皮下异位移植瘤凋亡相关基因（Bcl-2，cyclinD1，Bax，MDR1及NF-κB（P65））的蛋白水平变化。取移植瘤各处理组或收集各处理组及各自对照组，冷PBS洗涤3次，置于冷裂解液（50mmol/L Tris[PH 7.4]，150mmol/L NaCl，2.0mmol/L EDTA，1％NP-40）中，4℃离心12,000g 15min，按上述方法制备的20μg溶胞产物加到样本缓冲液中，煮沸，取等量蛋白行SDS-PAGE电泳，分离蛋白转印，脱脂奶粉封闭，加入一抗（1:200） 4℃过夜，TTBS漂洗5min，2次，与二抗（1:200）反应2h，漂洗2次，AP显色30min，成像分析软件Fluorchem V 2.0测定主带吸光度值计算上述指标的蛋白表达水平，以上实验重复6次。结果一、MTT法测定细胞生长抑制率不同浓度5-FU、sulfasalazine联合作用细胞BxPC-3生长抑制作用明显增强呈时间、剂量依赖性；不同浓度5-FU作用细胞BxPC-3生长抑制率随时间延长逐渐升高，不同浓度sulfasalazine作用的生长抑制率下降。二、PI染色法测定细胞BxPC-3中晚期凋亡率及细胞周期变化200mg/L sulfasalazine、100 mg/L 5-FU单独及联合作用细胞BxPC-3 12h凋亡率分别为2.68％，6.59％，10.52％，与各自对照组3.17％，1.50％，4.08％比较（t=2.33，P＞0.05，9.78，17.56，P＜0.01）)；作用48h凋亡率明显增加到7.63％，40.43％，64.69％，与对照组29.20％，5.61％，12.02％比较（t=17.06，33.66，94.51，P＜0.01）)。不同浓度（12.5，25，50，75，100mg/L）5-FU作用24h细胞凋亡率、S期细胞比例和增殖指数增加：然而随着sulfasalazine浓度增加作用24h细胞凋亡率从2.68％缓慢增加到7.63％，G₀/G₁期细胞比例从35.13％增加到54.32％，S期细胞比例从45.37％下降到16.67％，PI呈递减趋势；100mg/L 5-FU联合200mg/L sulfasalazine作用细胞BxPC-3不同时间G₀/G₁期细胞比例从43.31％（12h）到85.05％（48h），与对照组比较（t=7.93（12h），21.30（48h），P＜0.01），S期细胞比例从11.63％（12h）下降到4.47％（48h），与对照组比较（t=37.68（12h），8.60（48h），P＜0.01）。三、PI/Annexin-V双染法测定100mg/L 5-Fu，200mg/L sulfasalazine单独及联合作用BxPC-3不同时间的早期凋亡率随着时间延长，5-Fu单独作用时早期凋亡率逐渐升高，与阴性对照组（0.09％NaCl）比较（t=5.41，2.06，13.38，22.99，除24h P＞0.05外，其余均P＜0.01）；sulfasalazille单独作用时早期凋亡率呈先升高后下降趋势，不如5-Fu单独作用，与阴性对照组（0.2％DMSO）比较（t=2.65，4.53，2.32，3.78，P＜0.05）；但二者联合作用时早期凋亡率呈明显升高趋势，优于两个单独作用组，与阴性对照组（0.09％NaCl+0.2％DMSO）比较（t=5.58，17.35，24.95，33.67，P＜0.01）；100mg/L 5-Fu，200mg/L sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3早期凋亡率及阴性对照组（0.09％NaCl+0.2％DMSO）在12，24，36，48h经多因素方差分析表明二者之间存在明显交互作用即分别为F=52.23，245.14，277.34，418.93，P=0.000四、免疫细胞化学法检测结果（100mg/L）5-FU，（200mg/L） sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3 24h时NF-κB（P65），Bcl-2，cyclin D1蛋白表达与各自对照组比较三个指标平均吸光度值差异有统计学意义；同一指标各作用组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。多因素方差分析显示Bcl-2平均吸光度值在5-FU、sulfasalazine单独及联合作用组与阴性对照组（0.09％NaCl+0.2％DMSO）之间比较，二者存在明显交互作用，F=1216.57，P=0.000。五、相差显微镜下的细胞形态变化相差显微镜观察二者联合作用24h大量细胞固缩变圆，其阴性对照组少量细胞固缩变圆，胞体略肿胀：100mg/L5-FU作用24h较多细胞固缩变圆，其阴性对照组细胞基本无改变：200mg/L sulfasalazine作用24h少量细胞固缩变圆，其阴性对照组细胞胞体略肿胀。六、透射电镜观察细胞BxPC-3的超微结构变化（100mg/L）5-FU联合（200mg/L）sulfasalazine作用组细胞BxPC-3染色质向核膜下积聚，有凋亡小体形成，对照组细胞内质网较丰富；（100mg/L）5-FU作用时细胞核碎裂，对照组细胞微绒毛粗大，内质网丰富；（200mg/L）sulfasalazine作用时细胞核固缩，对照组细胞核分解。七、扫描电镜观察细胞表面的微细结构变化联合作用组细胞绒毛大量脱落变小，对照组细胞绒毛部分变小；100mg/L 5-FU作用绒毛大量萎缩，而对照组细胞绒毛粗大；200mg/L sulfaalazine作用时细胞绒毛较大，而对照组细胞绒毛变小，部分脱落；八、5-FU，sulfasalazino单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3mRNA和蛋白水平变化（100，50mg/L）5-FU，（100，200mg/L）sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-324h NF-κB（P65）mRNA相对含量为（0.51±0.06），（0.57±0.06），（0.19±0.03），（0.15±0.03），（0.24±0.04），（0.10±0.01），（0.40±0.06），（0.21±0.06），与各自对照组比较t=11.08，9.12，7.94，9.96，17.64，34.45，7.58，12.82，P＜0.01；作用24h其蛋白表达量为（2980.60±153.77），（2209.87±143.04），（3294.90±61.57），（1451.47±68.19），（2615.60±237.03），（440.27±31.73），（2483.33±241.72），（1289.67±183.11），与各自对照组比较t=7.99，12.08，23.79，10.40，6.49，59.97，7.27，19.49，P＜0.01：作用24h Bcl-2，cyclinD1在mRNA相对含量和蛋白表达量均与各自对照组比较P＜0.01：上述指标经多因素方差分析显示二者存在明显交互作用。九、5-Fu、sulfasalazine单独及联合作用皮下异位移植瘤mRNA和蛋白水平变化（7.5，15 mg/kg）5-FU，（10，20 mg/kg）sulfasalazine单独及联合作用皮下异位移植瘤NF-κB（P65）mRNA相对含量分别为（0.42±0.07），（0.50±0.05），（0.35±0.06），（0.22±0.03），（0.26±0.05），（0.21±0.02），（0.15±0.02），（0.09±0.03），与各自对照组比较t=19.16，17.67，0.71，9.61，13.58，18.56，21.78，24.89除t=0.71，P=0.48外，其余均P＜0.01，各作用组间经多因素方差分析显示二者存在明显交互作用（F=35.04，P=0.00）；其蛋白含量为（2070.45±93.09），（2594.74±76.55），（3574.78±117.54），（1837.57±104.25），（1998.90±168.06），（1156.31±96.45），（2474.04±114.22），（669.92±98.75），与各自对照组比较t=79.01，67.49，43.38，0.71，37.03，64.84，31.85，76.09（除t=0.71，P=0.49外，其余均P＜0.01）：Bcl-2，cyclinD1，MDR1三个指标在mRNA相对含量和蛋白表达量均与各自对照组比较P＜0.01：这些指标经多因素方差分析显示二者间存在明显交互作用。结论Sulfasalazine有抑制胰腺癌细胞BxPC-3增殖和增强5-FU诱导细胞凋亡作用，二者作用细胞BxPC-3有协同生长抑制作用，此作用与二者协同诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞于G₀/G₁期密切相关。Bcl-2，cyclinD1，MDR1及NF-κB（P65）mRNA和蛋白水平下调是sulfasalazine协同增强5-FU诱导细胞BxPC-3凋亡作用机制之一。Sulfasalazine可协同增强5-FU诱导裸鼠皮下异位移植瘤胰腺癌细胞BxPC-3凋亡作用：Bax水平上调，Bcl-2，cyclinD1，MDR1及NF-κB（P65）水平下调可能是二者联合作用皮下异位移植瘤凋亡机制之一。