骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度的增殖和自我更新能力,并可分化为多种不同类型组织细胞。多年来,人们对骨髓的研究主要集中在造血干细胞上,并取得了可喜的成果。骨髓间充质干细胞一度被认为主要对造血干细胞的生长、增殖和分化起营养和支持作用,所以又称之为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)。而近年来,随着研究的深入,骨髓间充质干细胞的作用逐渐被拓展,人们发现骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,能够在一定条件下分化为包括神经细胞和胶质细胞在内的多种成体细胞。骨髓中这种非造血干细胞是中胚层来源的未分化细胞,目前已成功建立了一套较完整的体外培养扩增体系,并证实经有关化学物质诱导,MSCs在体外可以分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞等细胞类型。应用自体或异体细胞来取代、修复或加强受损组织、器官或系统生物学功能的治疗方法称之为细胞治疗。随着对骨髓MSCs研究的深入,MSCs在细胞治疗上所具有的潜在应用价值逐渐被人们认识。通过自体或异体移植MSCs进行细胞治疗,许多目前难以治疗的疾病如帕金森氏病和阿尔海默茨病等困扰老年人的疾病将可能被攻克。在神经系统外伤、手术后遗症、缺血性或出血性等疾病中也同样具有很大的潜力。但在体的MSCs迁徙分化不容易被控制,所以体外诱导MSCs分化的研究将为临床移植提供必要的理论依据和治疗基础。在神经系统疾病中,系统功能受到损害,现行的药物治疗、介入治疗和基因治疗对部分病人并不能取得满意的疗效。研究发现MSCs在体内及体外试验中,均可以向神经元样细胞或胶质样细胞分化。这为临床治疗带来新的希望。目前已应用于临床的胚胎干细胞移植存在取材、伦理、法律及免疫排斥等多种问题,这些缺陷限制了它在临床上的应用。而对于MSCs来说,则不存在上述困扰,其优点显而易见。首先MSCs来源广泛,间叶组织来源的很多组织器官已经发现MSCs的存在;其次取材方便,通常可取自自体骨髓,简单的骨髓穿刺就可获得;另外由于细胞取自自体,应用其诱导分化而来的组织细胞进行移植不存在组织配型及免疫排斥的问题;分化较容易,虽然体外诱导条件较难控制,但其环境依赖性很强,容易接受<WP=9>各种诱导因素的影响;而且易于外源基因的转染和表达,外源基因修饰的MSCs仍具有干细胞的高度增殖和自我更新特性,在体外可被大量扩增,可获得足够的工程细胞用于治疗。相对于胚胎干细胞的取材也不存在伦理和法律的问题。所以MSCs作为细胞治疗的移植来源,将为神经系统疾病的医治开辟一条更理想的途径。本课题在建立大鼠骨髓MSCs体外分离、培养、纯化及扩增体系的基础上,研究MSCs在体外培养中的生物学特性,以及向神经细胞分化的能力,为进一步临床治疗提供理论依据及治疗基础。实验证实成体骨髓中存在具有多向分化潜力的成体干细胞,在体外增殖迅速,能够在BMP2、BME、BDNF、bFGF、EGF等因子的作用下,分化为神经元样细胞,这为今后的临床移植治疗提供了潜在的细胞源泉。实验采用密度为1.073g/cm3的Percoll分离液,通过密度梯度离心法分离得到大鼠骨髓单个核细胞,利用MSCs贴壁速率快的特点,接种早期更换培养基去掉非贴壁细胞。经原代及传代培养扩增MSCs后,研究其在体外培养中的生长曲线、贴壁率、分裂指数、细胞周期等生物学特性及其超微结构,并在脂肪细胞诱导体系的作用下诱导其向脂肪细胞分化,从而鉴定其分化潜能。在此基础上,通过BMP2、BME、BDNF、bFGF、EGF等几种诱导因子的作用,诱导MSCs向神经元样细胞或胶质样细胞分化,观察细胞形态变化,以免疫细胞化学检测nestin、NSE、GFAP的表达作为观测指标。实验结果如下:贴壁培养法结合密度梯度离心,获得纯度较高的MSCs;进行了细胞生长曲线、贴壁率、分裂指数、周期等生物学特性和超微结构的观测,结果与间充质干细胞的生物学特性相吻合。本实验分离的细胞群在体外可以被诱导分化为脂肪细胞,大部分细胞为SH3免疫细胞化学染色阳性,透视电镜观察显示培养细胞属于较幼稚待分化的细胞类型。使用BMP2、BME、BDNF、bFGF、EGF等因子诱导MSCs后可见到神经元样或胶质样细胞出现,nestin、NSE、GFAP免疫组化证实了大量神经系统细胞表面抗原的表达,且与对照组差异显著。BMP2单独诱导可以使MSCs部分分化为神经元样或胶质样细胞,采用BMP2、BDNF、bFGF和EGF协同诱导后出现较多神经元样或胶质样细胞,且nestin、NSE、GFAP阳性细胞显著增多,细胞生长状况较佳。BME诱导间充质干细胞能较早地分化为神经元样或胶质样细胞,诱导后nestin、NSE、GFAP阳性细胞较多(与BMP2、BDNF、bFGF和EGF联合诱导组无显著差异),但细胞生长状况较差,在早期即有大量细胞细胞死亡。 <WP=10>结论:1.本实验分离培养的细胞群与间充质干细胞的生物学特性吻合,具有向脂肪细胞和神经细胞分化的潜能,SH3免疫细胞化学染色证实为非造血细胞,电镜结果显示为较幼稚细胞,表明此细胞群为间充质干细胞;2.BMP2等多种诱导因素能够诱导MSCs向神经元样或胶质样细胞分化,协同采用BMP2、BDNF、bFGF和EGF的诱导结果最佳,且细胞生长状况较好;3.成年大鼠骨髓中存在具有多分化潜能的MSCs,易于体外扩增,在一定条