PPR蛋白是一类能特异识别并结合RNA的蛋白,在真核生物RNA的多种代谢途径中起着非常重要的作用。它广泛分布在高等植物中,主要定位于叶绿体和线粒体。通常情况下,PPR蛋白含有2-30个串联重复单元,每个重复单元含有35个氨基酸,其识别RNA的方式是模块化的,即一个重复单元识别一个RNA碱基,这种模块化的识别特点赋予PPR蛋白可被人工设计并用于RNA操作的潜力。已有的生物信息学分析和结构生物学研究表明,每个重复单元的第5位、35位氨基酸在RNA特异识别过程中起着至关重要的作用,被称为氨基酸组合识别密码(code)。理论上,这种氨基酸组合识别密码理论上有400种,目前,只有少部分code通过生化和结构的研究方法被解析,而大多数的code与RNA碱基之间的对应关系及具体的识别机制还不是很清楚,这对于PPR蛋白功能研究及其进一步应用十分不利,因此亟需破解PPR蛋白的不同氨基酸组合与所识别的RNA碱基之间的对应关系。这需要大量不同code的PPR蛋白,合成这样的具有串联重复序列的PPR基因耗时长且成本高昂。本研究致力于开发一种高效、快速、经济的组装方法用于构建具有不同code的人工设计PPR(designer PPR,dPPR)序列。本研究基于Type IIs限制性内切酶的序列识别特点和Golden Gate cloning的基本原理进行设计改造,分三步构建全长dPPR序列。以构建10 repeats(10R)为例,第一步通过“限制性酶切-连接”一步法构建3 repeats(3R)初级元件,第二步将3R元件通过“限制性酶切-连接”一步法构建9 repeats(9R)二级元件,第三步将9R元件克隆构建在改造的表达接收载体上,表达接收载体上含有1个“repeat”,最终拼接成完整的具有10个重复单元的dPPR序列。本研究成功利用组装的序列表达出目标蛋白,并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、电泳迁移率实验的方法验证了数种密码与RNA碱基之间的对应关系。综上所述,本研究首次开发了一套快速高效的方法用于组装能识别特定碱基的dPPR序列,成功进行了蛋白表达和纯化,并验证了表达蛋白的活性。该方法的运用可极大地提高对PPR蛋白功能的研究效率,为PPR蛋白作为潜在的基因操作工具打下了坚实的基础。