论文部分内容阅读
目的：优化单甲氧基聚乙二醇琥珀酰胺酯(mPEG-NHS,20kD)修饰重组人干扰素α-2b(rhIFNα-2b)的条件,并对修饰产物分离纯化,获得符合新药申报要求的目标产物—PEG-rhIFNα-2b;以该目标产物为研究对象,考察其理化性质,动物体内的药代动力学性质和免疫原性以及药效学特性。方法：通过SDS-PAGE R250染色的扫描图谱分析不同条件对修饰反应的影响进而优化修饰条件；结合离子交换和分子筛两步色谱方法对修饰产物分离纯化。分别采用蛋白免疫印迹和PEG染色鉴定目标产物；还原型SDS-PAGE测定分子量；紫外线吸收法、Lowry法和BCA法同时测定蛋白含量；SDS-PAGE银染、SEC-HPLC、RP-HPLC对其纯度进行研究；细胞病变抑制法测定效价。小鼠皮下单剂量注射PEG-rhIFNα-2b及rhIFNα-2b,采用ELISA双抗夹心法检测血清中的药物浓度,计算药动学参数；将rhIFNα-2b及PEG-rhIFNα-2b按照每日给药频率及临床给药频率腹腔免疫小鼠,分别采用ELISA间接法和细胞病变抑制法测定小鼠血清中结合抗体和中和抗体滴度。以HepG2.2.15为细胞模型,采用MTT法考察两种药物对细胞的毒性作用；分别以高、中、低剂量的PEG-rhIFNα-2b和rhIFNα-2b每隔一日反复作用细胞,连续八天,采用ELISA法测定细胞上清液中的HBsAg来考察两种药物对病毒的抑制作用；将相同剂量的PEG-rhIFNα-2b和rhIFNα-2b模拟临床给药频率作用细胞一周,即PEG-rhIFNα-2b给药1次,rhIFNα-2b给药3次,观察细胞HBsAg的分泌情况,评价药效。结果：筛选出PEG修饰rhIFNα-2b的最佳条件即在pH为9.0、投料比为3／1、温度为4℃、时间为2h的条件下,获得的PEG-rhIFNα-2b得率为48.47%；经两步纯化后终产品得率约为24.72%。经鉴定,PEG修饰在rhIFNα-2b上并没有改变rhIFNα-2b的抗原决定簇；还原型SDS-PAGE测得PEG-rhIFNα-2b分子量为44.06kD；紫外光谱测定PEG-rhIFNα-2b的最大吸收峰为279.5nm, rhIFNα-2b的最大吸收峰为280nm,表明PEG修饰并未对rhIFNα-2b在230～330nm的最大吸收峰值产生较大影响；通过SDS-PAGE银染、SEC-HPLC、RP-HPLC测得PEG-rhIFNα-2b纯度大于95%,符合生物技术药物研究开发和质量控制标准；效价测定表明rhIFNα-2b经PEG修饰后,活性保留了原先的11.8%。药代动力学实验证明,rhIFNα-2b经PEG修饰后,半衰期由原先的1.670h延长至7.670h,增加了近5倍；药—时曲线线下面积AUC由700.173 ng·h/mL提高至4709.97 ng·h/mL,提高了6.7倍,体内清除率则由0.357 mL/h·kg下降至0.053mL/h·kg,下降了6.73倍,均有显著性差异；免疫原性实验发现,按每日给药频率时,rhIFNα-2b诱导产生的结合抗体和中和抗体滴度分别为7517.72和77.63,而PEG-rhIFNα-2b的分别为694.62和26.98；按临床给药频率时,rhIFNα-2b诱导产生的结合抗体和中和抗体滴度分别为5538.51和44.99,而PEG-rhIFNα-2b的分别为311.61和12.96；药效学实验测得PEG-rhIFNα-2b和rhIFNα-2b的TC50均>20000IU/mL,IC50分别为559.88、478.71IU/mL;反复给药时,高、中、低三个剂量组的PEG-rhIFNα-2b对病毒的抑制作用略低于同剂量的rhIFNα-2b;模拟临床给药一周后发现,PEG-rhIFNα-2b与rhIFNα-2b对病毒的抑制作用无显著性差异。结论：建立了一个稳定的高比例PEG-IFNα-2b的修饰工艺和一个高纯度(纯度>95%)PEG-IFNα-2b的纯化工艺；按新生物制品申报要求,建立了PEG-IFNα-2b质量标准中部分理化性质的研究方法；小鼠体内的药动学及免疫原性研究表明PEG修饰rhIFNα-2b可显著延长其体内半衰期,降低免疫原性；药效学实验表明PEG修饰并没有影响rhIFNα-2b的体外抗乙肝病毒作用。本研究分别从PEG-rhIFNα-2b的理化性质、药代动力学、药效学等方面较全面的评价了PEG修饰对rhIFNα-2b的影响,为PEG-rhIFNα-2b的研究和产业化提供理论依据和数据支持。