过氧化氢胁迫下耐辐射奇球菌中FMN riboswitch的功能研究

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耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)是迄今为止发现的对电离辐射最具抗性的生物之一。此外,它还对紫外线、干燥和过氧化氢等损伤因子均表现出极强的抗性,而这种抗性主要归因于其具有超强的DNA损伤修复能力和高效的抗氧化保护机制。研究发现,D。radiodurans在受到电离辐射、氧化或紫外线等胁迫作用下,其机体内80%DNA损伤都是由活性氧(ROS)攻击间接引起的。FMN(flavinmononucleotide)是黄素蛋白的辅基,参与氧化还原反应、催化脱氢、氧化和电子转移或羟基化过程,在呼吸等生物氧化过程的电子传递中具有重要作用。黄素单核苷酸核糖开关是一种能调控黄素单核苷酸生物合成和转运基因的特异性mRNA非编码小分子,能与其小分子代谢物(FMN)结合或通过感应外界环境信号而引起自身构象发生变化,从而调控基因表达,且不需要蛋白因子参与。   本论文运用生物信息学方法,对D.radiodurans中FMNriboswitch的序列、二级结构和生物学功能进行比对与分析。结果显示,FMNriboswitch位于DR0153基因(核黄素特异性脱氨基酶)的5端非编码区域,全长149bp,适体结构域具有一定保守性。通过targetRNA和sRNATarget预测软件分析,预测出D.radiodurans中FMNriboswitch有8个靶基因,其中2个为DR2263和DR1366,分别具有编码Dps蛋白基因和调控磷酸核糖酰胺转移酶的功能,另外6个是功能未知基因,对FMNriboswitch的结构和功能研究奠定了理论基础。   采用体外重叠延伸PCR扩增技术和体内同源重组技术,成功构建了耐辐射奇球菌FMNriboswitch功能缺失突变株。对野生型和突变株分别进行生长曲线的测定,结果表明,突变株生长延缓,生长速度比野生型R1慢。对野生型和突变株用不同浓度(10,20,30,40,50mM)H2O2处理后,突变株存活率较野生株R1低,说明FMNriboswitch的缺失使D.radiodurans对H2O2的抗性减弱。用30%H2O2处理D.radiodurans后继续在正常条件下培养,并分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h取样,利用荧光定量PCR技术检测FMNriboswitch的表达差异。结果发现,D.radiodurans在受到30%H2O2的胁迫氧化后,4h内表现为先上调后下调的趋势。以上结果表明,FMNriboswitch参与D.radiodurans氧化抗性的形成,可能在高效的氧化保护体系中发挥重要的作用。本文对耐辐射奇球菌中FMNriboswitch在氧化胁迫过程中作用的研究,有助于理解sRNA在这种具有极端抗性菌体中的作用。
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