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MicroRNAs是一类内源性长约22个核苷酸的非编码单链RNA，它通过与靶mRNA的3非翻译区(3UTR)互补配对，从而在转录后水平抑制该基因的表达，以此发挥其生物学功能。MicroRNA-27a被证实可通过抑制小鼠肌肉生长抑制素(myostatin)基因表达促进小鼠成肌细胞系C2C12细胞的增殖。但microRNA-27a是否可调控猪成肌细胞的增殖，其机制是否与猪myostatin有关，目前并不清楚。因此，本研究旨在以猪成肌细胞为研究对象，探究microRNA-27a是否靶向myostatin调节猪成肌细胞的增殖。本研究共包括以下三个试验: 试验一猪myostatin为microRNA-27a靶基因的鉴定 Myostatin是骨骼肌生长发育的关键负调控因子，但猪myostatin3UTR全长序列目前尚不清楚。为此，本研究采用3-cDNA末端快速扩增(3-RACE)技术成功扩增出猪myostatin3UTR全长序列，其大小为638 bp，提交至GenBank后获得登录号为KC299915。序列分析发现，猪myostatin3UTR上游63-69 bp处存在与microRNA-27a“种子序列”（5端第2～8个碱基）相结合的序列。为确定microRNA-27a能否与猪myostatin3UTR结合，亚克隆野生型猪myostatin3UTR，突变与microRNA-27a“种子序列”互补的区域以制备猪myostatin3UTR的突变型，将野生型和突变型猪myostatin3UTR插入到psiCHECK-2载体构建成连接有野生型或突变型猪myostatin3UTR的荧光素酶报告基因质粒。应用脂质体Lipofectamine2000分别将0.5μg上述荧光素酶报告基因质粒与50 nM microRNA-27a mimics或microRNA mimics Negative Control（对照组）共转染HEK-293T细胞，48 h后检测荧光素酶活性的差异。结果表明，在转染野生型猪myostatin3UTR的荧光素酶报告基因质粒组中，microRNA-27a mimics组的荧光素酶活性与对照组相比降低至（0.43±0.02）;而在转染突变型猪myostatin3UTR的荧光素酶报告基因质粒的试验中，microRNA-27a mimics组与对照组相比，无统计学差异。通过上述荧光素酶报告基因试验证实猪myostatin为microRNA-27a的靶基因。同时，实时荧光定量PCR结果表明，猪腹部脂肪组织和各类肌肉组织中microRNA-27a和myostatin的表达呈相反规律。 试验二猪myostatin对microRNA-27a表达的影响 MicroRNA与其靶基因之间常存在相互调控作用。为探究microRNA-27a与猪myostatin间是否存在相互调控作用，克隆猪myostatin完整编码区，将其插入pcDNA3.1(+)载体构建成pcDNA3.1(+)-MSTN表达质粒，用脂质体Lipofectamine2000分别将0.5μg pcDNA3.1(+)-MSTN及其对照空载体pcDNA3.1(+)转染经形态学、desmin免疫组化和MyHC蛋白免疫荧光鉴定的原代猪成肌细胞，24 h后进行检测。EdU细胞增殖分析结果表明，与转染空载质粒组相比（25.5±4.4％），转染重组质粒组成肌细胞的增殖率显著降低（19.5±3.9％）。实时荧光定量PCR结果表明，猪myostatin的表达水平显著升高（330.5±14.3），microRNA-27a的表达水平显著下降（0.89±0.02）。实验一与实验二结果表明，microRNA-27a与猪myostatin间存在相互调控作用。 试验三 microRNA-27a对猪成肌细胞增殖的影响及其机理 本研究以猪成肌细胞为对象，研究microRNA-27a在猪成肌细胞增殖过程中的作用及其机理。研究首先考察了猪成肌细胞增殖过程中microRNA-27a与myostatin的表达规律。实时荧光定量PCR结果表明，在猪成肌细胞增殖过程（0-6天）中，microRNA-27a的表达量显著上调，myostatin的表达水平显著降低。用脂质体Lipofectamine2000将50 nM microRNA-27a mimics或microRNA mimics NegativeControl转染猪成肌细胞，24 h后进行检测。EdU细胞增殖分析结果表明，与对照组相比（9±2.1％），转染microRNA-27a mimics组猪成肌细胞的增殖率显著升高（12±2.8％）。实时荧光定量PCR结果表明，microRNA-27a的表达水平显著升高（29.78±1.09），同时猪myostatin的表达水平显著降低（0.35±0.01）。上述结果表明，microRNA-27a具有促猪成肌细胞增殖的功能，且通过下调猪myostatin的表达来实现。 总之，本研究成功克隆了猪myostatin3UTR全长序列，证实了猪myostatin为microRNA-27a的靶基因且它们之间存在相互调控作用，同时证实了microRNA-27a通过抑制猪myostain的表达促进猪成肌细胞的增殖。