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病毒与宿主的相互作用一直以来就是病毒学家们高度关注的重要科学问题。目前,虽然二者互作的一些机制得到阐明,但microRNA (miRNA)参与的相互作用网络还亟待研究和发现。MiRNA是一类内源的长度约为18-23个核苷酸的单链非编码小分子RNA,通过抑制靶基因mRNA的翻译过程或者降解靶基因的mRNA分子,介导转录后基因表达的调控。MiRNA不但可以参与调控细胞增殖、分化、造血等一系列的生理过程,还可以参与调控病毒与宿主细胞的相互作用。目前,在泡沫病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒及流感病毒中均存在宿主miRNA调节病毒感染的现象。为了便于进行miRNA参与病毒感染过程相应的探索,我们选取了一种简单的细小病毒—水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus, MEV)作为模型进行研究。MEV是细小病毒科的一种,普遍认为是猫细小病毒的一个变种。MEV有强大的抵抗力并且传播速度很快,能够造成养貂业的巨大损失。MEV是一种单链DNA病毒,其基因组主要包含两个ORF,一个ORF编码功能性非结构蛋白(None-structural protein, NS),另一个ORF主要编码衣壳蛋白。为了探究miRNA在MEV感染过程中的作用,本文利用高通量测序技术和生物信息学手段对F81细胞感染MEV前后miRNA表达谱进行分析研究,从而筛选出可能参与到MEV感染过程中的miRNA,最终通过实验对miRNA的功能进行鉴定。我们首先得到F81细胞系感染MEV前后的两个小RNA数据库。经过比对发现,两个数据库有196个成熟体miRNA和97个miRNA*与哺乳动物的已知miRNA是同源的,这些miRNA分属于152个miRNA家族；在F81细胞系感染MEV前后的两个数据库中,分别预测得到384和398个新的miRNA前体。采用实时荧光定量PCR (qPCR)的方法对F81细胞感染MEV前后miRNA的表达差异进行了鉴定,在随机挑选的16个miRNA中,大部分miRNA的差异水平(12/16)与高通量测序结果是相符的。利用miRNA靶标预测软件从数据库中筛选出可能直接作用于MEV mRNA的8个miRNA和可能作用于MEV受体-转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TfR)的6个miRNA,这些miRNA可能与MEV感染相关。在预测得到的8个有可能直接作用于MEV mRNA的miRNA中,高通量测序结果显示miR-181b的表达量较高,并且预测得到miR-181b的假定靶标为MEV的NS1mRNA,该靶标序列在不同的细小病毒中是高度保守的。分别转染合成的miRNA模拟物mimics和抑制剂inhibitors,测定不同感染时间MEV病毒滴度及其基因组DNA水平,并采用流式细胞术对细胞感染MEV的水平进行测定,然后对MEV造成细胞病变水平及MEV间接免疫荧光进行观察,结果证实miR-181b mimics能够抑制病毒增殖并且miR-181b inhibitors在病毒感染后期能够促进病毒增殖。双荧光素酶报告基因检测实验证明了miR-181b假定靶标的真实性。MiR-181b通过靶向NS1mRNA编码区导致NS1蛋白的翻译抑制。通过检测miR-181b对MEV假定靶标突变株的作用,验证了miR-181b是通过靶向预测靶标抑制MEV增殖的。Argonaute2(Ago2)蛋白的免疫共沉淀实验证明miR-181b能够在RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中与NS1mRNA相互结合。qPCR结果显示MEV感染也会导致宿主F81细胞miRNA表达量发生变化,miR-181b随MEV感染时间的延长其表达量逐渐降低。这些表明F81细胞的miR-181b能够通过靶向MEV NS1mRNA的编码区抑制NS1表达,从而抑制MEV的增殖。MEV感染需要转铁蛋白受体TfR介导。通过同源比对,克隆出了猫的TfR mRNA3’非翻译区Untranslated region, UTR),并预测得到6个miRNA可能作用于其上。qPCR和western blot实验鉴定出miR-320a和miR-140能够抑制TfR的表达,流式细胞术测定实验也证明2个miRNA能够降低细胞TfR的表达。MEV感染能够导致2个niRNA表达逐渐上调,而TfR随之逐渐下调。双荧光素酶报告基因检测实验证明了2个miRNA假定靶标的真实性。Ago2蛋白的免疫共沉淀实验证明2个miRNA能够在RISC中与TfR mRNA相互结合。通过对不同病毒感染时间病毒基因组DNA的定量,验证了2个miRNA能够通过阻止病毒进入宿主细胞而控制MEV感染。共转染2个miRNA后对TfR表达水平及病毒基因组DNA水平测定,结果发现二者对TfR表达及MEV感染细胞能起到协同抑制作用。这些结果表明F81细胞的miR-320a和miR-140能够靶向MEV受体TfR mRNA的3’UTR区抑制TfR的表达,从而减少MEV侵入细胞。本研究构建了F81细胞感染MEV前后的miRNA数据库；并证实miR-181b能够通过抑制MEV NS1的表达抑制病毒增殖；而miR-320a和miR-140又能够通过抑制MEV受体TfR的表达控制MEV的感染。上述研究结果在miRNA层面上进一步阐明了MEV感染机制,为防治MEV提供了新的思路。