【摘 要】
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高盐蛋白来自于嗜盐菌,与普通的蛋白相比,它们具有耐盐性、耐高温性、宽泛的p H范围和有机溶剂适应性等特点,因此在生物技术和工业方面都有巨大的应用潜力。但该类蛋白在大肠杆菌等细菌中表达时,它们易以包涵体的形式获得,则后续还需进行变性和复性等一系列繁琐的过程,极大的增加了高盐蛋白的生产成本。聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）是由于碳源过剩,而氮、磷等受限时,微生物合成
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高盐蛋白来自于嗜盐菌,与普通的蛋白相比,它们具有耐盐性、耐高温性、宽泛的p H范围和有机溶剂适应性等特点,因此在生物技术和工业方面都有巨大的应用潜力。但该类蛋白在大肠杆菌等细菌中表达时,它们易以包涵体的形式获得,则后续还需进行变性和复性等一系列繁琐的过程,极大的增加了高盐蛋白的生产成本。聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）是由于碳源过剩,而氮、磷等受限时,微生物合成的一种生物聚酯,它以颗粒的形式存在,且表面有多种结合蛋白,被视为“天然的亲和柱”,可用于蛋白固定化的融合表达及快速纯化。本研究选择以极端嗜盐古菌地中海富盐菌Haloferax mediterranei为宿主,以PHA颗粒表面的结合蛋白PhaP为亲和标签,并加入凝血酶（Thrombin）酶切位点,构建了基于PHA颗粒固定化的高盐蛋白表达纯化系统。本实验选择了H.mediterranei中的三个超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和两个乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）为研究对象,构建了融合表达载体:p WL502-pha P-Th-sod1、p WL502-pha P-Th-sod2、p WL502-pha P-Th-sod3、p WL502-pha P-Th-adh1、和p WL502-pha P-Th-adh2,以及sod的过表达载体和敲除载体。结果显示在H.mediterranei DF50中成功表达了PhaP-Th-SOD1、PhaP-Th-SOD2、PhaP-Th-SOD3,在H.mediterraneiΔpha RP中成功表达了PhaP-Th-ADH1和PhaP-Th-ADH2。通过凝血酶酶切释放目的蛋白,测定其活力,同时测定还固定在PHA颗粒上SOD和ADH活力。纯化后的SOD1、SOD2、SOD3活力分别为2290.90U/mg、2207.83U/mg、1944.10U/mg,PHA颗粒固定化SOD的活力依次PHA-PhaP-Th-SOD1为612.85U/mg、PHA-PhaP-Th-SOD2为686.4U/mg、PHA-PhaP-Th-SOD3为638.53U/mg。探索了PHA颗粒固定化后的酶活力稳定性,在两月后再次测定PHA颗粒固定化SOD活力,发现其活力只分别减少了2.5%、11.8%和17.1%,而纯化后SOD在两月后其活力减少了70%至80%,这为蛋白或酶的保存提供了一种新思路。此外,研究了地中海富盐菌SOD的稳定性,15%Na Cl下,SOD2和SOD3的活力保持了约85%;与有机溶剂孵育后,酶活力均是一个增强状态;温度达到70℃时,SOD1相对酶活为91%。同时SOD显示出良好的清除超氧阴离子的抗氧化能力。原始菌株ADH活力为0.0458U/mg,测定PHA颗粒固定化ADH的活力,PHA-PhaP-Th-ADH1为4.39U/mg、PHA-PhaP-Th-ADH2为4.65U/mg。同时,研究了PHA颗粒固定化ADH的酶学性质,结果显示PHA-PhaP-Th-ADH1最适反应温度为35℃、最适p H为6,Zn2+的加入对其活性无太大影响;PHA-PhaP-Th-ADH2最适反应温度为25℃、最适p H为6,而Fe2+和Mn2+会使其活性增强。本研究以PhaP为标签构建了PHA固定化表达纯化系统,实现了嗜盐古菌超氧化物歧化酶和乙醇脱氢酶的表达纯化及活性鉴定,为高盐蛋白的表达提供宝贵经验;且发现不同SOD间的活力及抗氧化能力等方面也有所不同;同时分析了PHA颗粒固定化对酶活力的影响,为酶的储存和固定化提供新思路。
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