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镉(cadmium, Cd)是一种有毒的重金属元素,易在体内蓄积,镉能够诱导多种器官或组织损伤并导致相关功能丧失,包括肾脏、肝脏、肺脏、骨骼、心血管系统和免疫系统。体内外研究均证明,镉可引起细胞凋亡、氧化损伤及DNA损伤,且凋亡与氧化应激、线粒体损伤、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、死亡受体、Caspase及非Caspase依赖性通路的激活密切相关。肝脏是镉损伤的主要靶器官之一,目前对镉致肝细胞损伤研究较多,但其作用机制还不完全清楚。本研究以大鼠肝细胞系BRL3A细胞为模型,采用细胞生物学和分子生物学方法研究镉对BRL3A细胞的毒性作用机制及NAC的保护作用。研究内容如下：1.镉致BRL3A细胞毒性损伤及NAC的保护作用为研究镉致BRL3A细胞的毒性损伤及NAC的保护作用,以0、10、20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(分别为a-d组),同时以2mmol/LNAC、2mmol/L NAC(预孵育30min)+20μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(为e-f组)。倒置显微镜观察细胞形态的变化,采用MTT法测定细胞存活率,比色法测定培养上清中LDH活性。结果表明,随着镉浓度的增加,细胞皱缩、变圆、结构不完整,细胞存活率逐渐降低(p<0.01),LDH释放量显著增加(p<0.05); NAC单独处理组细胞形态、细胞存活率和LDH释放量与对照组差异不显著(p>0.05); NAC与镉联合处理组细胞形态皱缩,细胞存活率极显著升高(p<0.01),上清中LDH活性极显著降低(p<0.01)。表明NAC可有效保护镉致BRL3A细胞的毒性损伤。2.镉致BRL3A细胞凋亡及NAC的保护作用为研究镉对BRL3A细胞凋亡的影响及NAC的保护作用,以0、10、20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(分别为a-d组),同时以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(预孵育30min)+20μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(为e-f组)。Hoechst33258荧光染色观察细胞核的形态变化,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果表明,随着镉浓度的增加,细胞染色质浓缩,有的呈新月形,甚至出现核碎裂；镉致BRL3A细胞凋亡率显著或极显著升高(p<0.01或p<0.05)；NAC单独处理组细胞核状态和凋亡率均与对照组差异不显著(p>0.05),NAC与镉联合处理组细胞凋亡形态有所减少,凋亡率极显著降低(p<0.01)。表明NAC可有效降低镉致BRL3A细胞的凋亡。3.镉对BRL3A细胞I)NA损伤的研究为研究镉致BRL3A细胞的DNA损伤,以0、10、20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(分别为a-d组),通过单细胞凝胶电泳法测定细胞DNA损伤。结果表明,随着镉浓度的增加,受损细胞彗星率、拖尾长度、尾部DNA含量均显著或极显著升高(p<0.01或p<0.05)。表明镉可引起BRL3A细胞DNA损伤,并呈剂量—效应关系。4.镉致BRL3A细胞氧化损伤及NAC的保护作用为研究镉致BRL3A细胞的氧化损伤及NAC的保护作用,以0、10.20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(分别为a-d组),同时以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(预孵育30min)+20μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(为e-f组)。流式细胞术检测细胞内ROS水平,比色法检测MDA含量及SOD、GSH-Px活性的变化。结果表明,随着镉浓度的增加,细胞ROS、MDA含量显著或极显著升高(p<0.01或p<0.05),SOD、GSH-Px活性显著或极显著降低(p<0.01或p<0.05);NAC单独处理组细胞ROS、MDA含量及SOD、 GSH-Px活性均与对照组差异不显著(p>0.05)；NAC与镉联合处理组细胞ROS含量显著降低(p<0.05), SOD、GSH-Px活性显著或极显著增高(p<0.01或p<0.05)。表明镉致BRL3A细胞发生氧化损伤,NAC具有明显的效保作用。5.镉致BRL3A细胞线粒体损伤及NAC的保护作用为研究镉致BRL3A细胞线粒体损伤及NAC的保护作用,以0、10、20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞1213(分别为a-d组),同时以2mmol/LNAC、2mmol/L NAC(预孵育30min)+20μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(为e-f组)。透射电子显微镜观察细胞线粒体超微结构的变化,免疫荧光法检测AIF、EndoG蛋白表达,流式细胞术检测线粒体膜电位,比色法检测Caspase3、Caspse9活性的变化,同时用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测了Bax、Bcl-2的mRNA及蛋白,Caspse3、Caspase9及PARP的蛋白表达水平。结果表明,随着镉浓度的增加,线粒体数量减少、肿胀,嵴断裂,发生空泡化,线粒体膜电位均极显著降低(p<0.01),Caspase3、Caspase9活性显著或极显著升高(p<0.01或p<0.05), Bax蛋白及mRNA表达水平均显著增加,Bcl-2蛋白及mRNA表达水平均显著降低(p<0.01Caspase3、Caspase9、PARP的蛋白表达量均显著降低, Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9的蛋白表达量则显著增加；NAC单独处理组细胞线粒体结构正常,Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9、PARP蛋白与对照组无显著差异；NAC的联合应用可有效抑制镉致相关蛋白的变化的趋势。镉可使AIF、EndoG蛋白于线粒体和细胞浆转移入细胞核。表明Caspase和非Caspase途径均参与了镉致BRL3A细胞的凋亡,NAC可有效保护镉致BRL3A细胞的线粒体损伤。6.镉对BRL3A细胞MAPK信号通路的影响及NAC的保护作用为研究镉对BRL3A细胞MAPK信号通路的影响及NAC的保护作用,以0、10、20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h设为a-d组(分别为a-d组),同时以2mmol/L NAC、2mmol/LNAC(预孵育30min)+20μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(为e-f组)。另外,分别用10μmol/Lp38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126预孵育0.5h后,加入醋酸镉,使其终浓度20μmol/L作用12h。应用流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫印迹法检测MAPK蛋白表达。结果表明,10μmol/L SB203580、 SP600125、U0126处理组细胞凋亡率均极显著降低(p<0.01)。镉处理均能使P-JNK、P-p38的蛋白表达量显著增加,P-ERK在10-20μmol/L染镉组蛋白表达量显著降低,40μmol/L染镉组44kD P-ERK的蛋白磷酸化水平并未显著改变,42kD P-ERK的磷酸化水平则显著增高。表明MAPK途径参与了镉致BRL3A细胞的凋亡,NAC可有效抑制MAPK途径发挥一定的保护作用。7.镉对BRL3A细胞Fas/FasL信号通路的影响及NAC的保护作用为研究镉致BRL3A细胞Fas/FasL信号通路的影响及NAC的保护作用,以0、10、20、40μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(分别为a-d组),同时以2mmol/L NAC、2mmol/LNAC(预孵育30min)+20μmol/L醋酸镉分别作用BRL3A细胞12h(为e-f组)。比色法测定Caspase8的活性,免疫印迹法检测Caspase8、FasL蛋白,实时荧光定量PCR检测Fas、FasL mRNA的表达水平。结果表明,随着镉浓度的增加,细胞Caspase8的活性及Cleaved-Caspase8、FasL的蛋白和Fas mRNA的表达水平极显著增加(p<0.01)。FasL mRNA的表达水平则先降低后升高。联合应用NAC可显著抑制镉对Cleaved-Caspase8、FasL蛋白的上调。表明Fas/FasL途径与镉致BRL3A细胞凋亡有关,NAC可有效抑制Fas/FasL途径而发挥一定的保护作用。