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[研究背景]细胞坏死是受到受体相互作用激酶1(receptor-interactingprotein kinase 1,RIPK1),受体相互作用激酶 3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)和混合谱系激酶域样蛋白(MLKL)调控的程序性死亡方式。越来越多的研究证明,细胞程序性坏死与多种病理过程相关,例如:炎症性疾病,神经退行性疾病,肿瘤转移和缺血再灌注等等。因此,开发新的程序性坏死小分子抑制剂能够为治疗坏死相关疾病提供新的策略。[研究目的]通过预处理小分子化合物,再用经典细胞坏死诱导剂诱导TNF-介导的细胞程序性坏死,鉴定能够显著抑制细胞程序性坏死的化合物,阐明其抑制细胞程序性坏死的分子机制,并探究其在治疗程序性坏死相关疾病中的作用。[研究方法]我们用小分子抑制剂预处理人结肠癌细胞HT-29,用细胞程序性坏死诱导剂 TNF-α,Smac 模拟物和 Z-VAD(即 TNF-α+Smac mimic+Z-VAD,T+S+Z)协同处理细胞诱导细胞程序性坏死,以Cell Titer Glo测定细胞存活率鉴定出能高效抑制程序性坏死的小分子抑制剂。为了研究该化合物是如何抑制细胞坏死,我们利用细胞生物学相关方法研究其对细胞程序性坏死通路中关键步骤如RIPK1、RIPK3以及MLKL的活化的影响,并通过体外激酶实验研究该化合物对RIPK1和RIPK3激酶活性的影响。通过高剂量灌胃化合物,我们发现该化合物对动物器官和造血系统没有明显影响。为了解其在疾病中的作用,我们探讨其在系统性炎症反映综合征和肿瘤转移的作用。[研究结果]我们通过与化学实验室合作,发现了一个能高效抑制程序性坏死的小分子抑制剂PK199。在人和鼠中,其半数抑制量约为6-18nM左右。PK199能有效抑制细胞程序性坏死发生过程中RIPK1、RIPK3和MLKL的活化。同时,我们发现PK199对于由Toll样受体介导的细胞程序性坏死也有很好的抑制效果。通过人类激酶组学分析,我们发现PK199对于RIPK1激酶活性有高选择性。在高剂量条件下对小鼠连续灌胃14d,对小鼠脏器和造血系统没有出现明显影响。重要的是,PK199能保护TNF-α诱导的系统性炎症反应综合征引起的损伤。此外,PK199明显缓解尾静脉注射B16-F10细胞和RFP-LL2细胞向肺转移。[结论]综上所述,我发现了一个较高活性的小分子化合物PK199能高效抑制程序性细胞坏死通过抑制RIPK1激酶活性。PK199有效阻断系统性炎症反映综合征造成的组织损伤和炎症因子的产生,同时PK199有效抑制肺肿瘤RFP-LL2和黑色素瘤B16-F10转移。