论文部分内容阅读
本研究首次获得了日本鳗鲡(Anguilla japonica)Caspase6基因cDNA全长序列,命名为AjCasp6(GenBank号KJ726738)。该基因全长为1524 bp,其中开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为903 bp,编码300个氨基酸。其蛋白三维空间结构图与人类Caspase6十分相似,具有Caspase家族典型的CASc结构域,包括一个P20结构域(54aa-178 aa)和一个P10结构域(204 aa-298 aa),半胱氨酸活性位点“KPKIFIFQACRG”及组氨酸活性位点“HADADCFVCVFLSHG”。同源性分析显示AjCasp6氨基酸序列与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)相似性最高,为75%,与其他鱼类相似性在61%~75%之间。系统发育树表明,AjCasp6与其他鱼类Caspase6聚为一支,而哺乳类以及两栖类Caspase6聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明:AjCasp6基因在日本鳗鲡各组织中均有表达,其中鳃中表达量最高,肠、肝脏、肾脏、皮肤和血细胞中也有较高表达,而心脏和肌肉中的表达水平则相对较低。日本鳗鲡经LPS、poly I:C和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)刺激后,对其肾脏、肝脏、脾脏以及血细胞中AjCasp6基因在不同时相的表达变化进行了研究。结果表明:经LPS刺激后,AjCasp6基因在肝脏、肾脏和脾脏中的表达水平均有明显升高,而血细胞中表达量仅在3 h有所升高,但6 h则显著降低;poly I:C免疫注射后,肾脏、肝脏和脾脏中AjCasp6的表达量均有显著升高,而血细胞发现在6 h显著下降,12 h表达量略有升高;嗜水气单胞菌感染后,AjCasp6基因表达量在肾脏和肝脏显著上升,但在脾脏和血细胞中的表达量仅在6 h和48 h有所提高。研究了日本鳗鲡肝脏细胞经LPS、poly I:C、CpG、PGN以及三种不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的AjCasp6基因表达水平变化,结果表明:肝脏细胞经LPS、poly I:C和PGN刺激后,AjCasp6基因表达水平均有显著升高,而经CpG处理48 h后AjCasp6表达量显著降低。经浓度分别为10~6 cfu/mL、10~7 cfu/mL以及10~8 cfu/mL的嗜水气单胞菌感染后,AjCasp6表达量均有显著提高,其表达量与菌体浓度的增加呈正相关。进行了日本鳗鲡AjCasp6基因原核表达及其兔抗血清的制备,结果表明:构建的重组载体pGEX-4T-2-Aj Casp6可以在大肠杆菌中高效表达,重组蛋白的分子量约为60 kDa,其表达量随着诱导时间的延长而提高,经镍柱亲和层析后获得高纯度的AjCasp6重组蛋白,制备相应的兔抗血清经ELISA检测其效价高达52100。日本鳗鲡肝脏组织通过原代培养成功使细胞从组织块中迁出,且至传代培养中获得的肝脏细胞经多次传代以后细胞形态、增殖周期渐渐稳定。由于日本鳗鲡肝脏细胞独特的生长特性,因此其可以较长时间处于生长的平台期,在不更换培养液的情况下能够维持一个月而不至于大批细胞凋亡、解体,使用时直接消化传代即可用于后续实验。构建了日本鳗鲡AjCasp6绿色荧光融合蛋白表达载体pEGFP-N1-Aj Casp6,通过转染HEK-293T细胞对该蛋白的细胞定位进行了研究。结果表明,AjCasp6蛋白仅在细胞质中有所分布,作为对照的pEGFP-N1空载体转染HEK-293T细胞后,绿色荧光蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,提示AjCasp6主要在细胞质中参与细胞凋亡进程的调控作用。