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研究背景:肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。据全球癌症统计,肺癌位居全球恶性肿瘤发病率第二位,死亡率居榜首。在我国,肺癌患病率和肿瘤的相关死亡率均位列第一。肺癌的病理类型包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌,其中NSCLC占绝大多数。尽管诊疗手段不断优化,包括早期筛查及诊断,放疗技术的改进如调强放射治疗、立体定向放疗等,新的靶向、免疫药物的不断问世,以及治疗模式的改变,部分提高了肺癌的治疗效果,但肺癌的总体预后仍不理想,5年生存率仅19%。因此进一步探索肺癌治疗及预后靶点意义重大。La核糖核蛋白结构域家族成员7（La ribonucleoprotein domain family member 7,LARP7）属于RNA结合蛋白LARPs家族的一员,研究报道其在多种类型的肿瘤中充当肿瘤抑制因子,在肺癌细胞中LARP7通过调控基因的转录延伸过程和调节某些信号转导途径中的相关因子,调控细胞恶性生物学行为,导致肺癌细胞的转移。但是LARP7在肺癌组织中的作用及机制还没有被清晰的阐明。因此,在前期研究基础之上,本研究拟通过公共数据库中的测序数据入手探索LARP7在NSCLC肿瘤组织与正常组织中的表达差异,体内外功能实验检测LARP7对肺癌细胞系增殖、迁移、侵袭、凋亡以及肿瘤生长等生物学行为的影响;深入研究LARP7发挥作用的具体分子机制及可能的信号通路;为寻找NSCLC的诊断、预后及治疗的分子靶标提供新的方向和理论支持。方法:1)数据库探索LARP7对NSCLC进展和转移的作用:首先应用TCGA数据库数据分析NSCLC组织与正常组织LARP7表达水平,并应用K-M plot在线分析LARP7表达水平与预后之间的关系;2)在单中心样本库中验证公共数据集中的发现:选取本院NSCLC患者,检测肺癌肿瘤组织与癌旁正常组织的LARP7表达情况,并对临床NSCLC患者进行观察随访,分析LARP7表达水平与预后之间的关系;3)构建LARP7过表达肺癌细胞株:为探索LARP7在肺癌细胞中的作用,体外研究通过质粒转染构建LARP7过表达肺癌细胞株（LARP7）和空载体对照组（Ctrl）肺癌细胞株。分别应用q RT-PCR及Western-blot方法检测两组细胞LARP7基因及蛋白表达水平,评估过表达效率;4)体外功能实验检测LARP7对肺癌细胞系增殖、迁移、侵袭及凋亡等生物学行为的影响:运用CCK8实验及平板克隆试验评估细胞增殖能力,CCK8实验中对LAPR7和Ctrl细胞进行连续5天的细胞活性监测并记录OD值,OD值越大说明细胞数目越多,细胞活性越高,细胞的增殖能力越强;应用细胞划痕实验及Transwell小室实验评估LARP7对细胞迁移、侵袭能力的影响;使用流式细胞术Annexin V-PE/7-AAD法检测LARP7及Ctrl组细胞凋亡情况;5)体内实验观察LARP7对肿瘤生长的影响:在体外实验证实LARP7对肺癌细胞的抑制作用之后,我们进一步应用动物实验探索LARP7在体内对肺癌的作用。应用慢病毒包装的LARP7稳转肺癌细胞及慢病毒包装的空载体肺癌细胞接种在裸鼠腋下并成瘤,分别为A549-OE-LARP7和A549-Ctrl组,监测移植瘤体积并测量移植瘤重量,并对移植瘤进行免疫组化分析;6)进一步探索LARP7调控肺癌进展的机制:应用RNA-seq技术分析LARP7过表达引起差异表达的基因（Differential expressed genes,DEGs）和可变剪接事件（alternative splicing events,ASEs）,并分析DEGs及经调控的可变剪接相关基因（regulated alternative splicing genes,RASGs）富集的生物功能;7)验证LARP7对基因差异表达及可变剪接的调控:挑选出显著变化并与肺癌相关的DEGs及RASGs,应用q RT-PCR检测LARP7过表达组及对照组差异基因表达量及基因可变剪接体变化。结果:1)TCGA数据库分析发现,与正常组织相比,LARP7在NSCLC的肿瘤组织标本中表达降低;且来自GEPIA2在线网站的分组模型显示,LARP7低表达组的临床预后显著差于LARP7高表达组,差异具有统计学意义（P=0.00082,HR=0.79）;2)基于我院单中心样本库中随机选取的6名肺癌患者的组织标本,对癌肿组织和癌旁组织分别检测LARP7的蛋白表达,发现LARP7在肺癌组织中的表达要低于癌旁组织,免疫组化染色分析结果与此一致,即与匹配的癌旁组织相比,LARP7在肺癌组织样本中显著低表达。通过对我院56例NSCLC患者进行追踪随访,Log-rank生存曲线比较也验证了公共数据库中的发现,即LARP7低表达的患者的生存率明显差于LARP7高表达的患者。3)应用q RT-PCR检测LARP7组与Ctrl组基因表达,结果发现与Ctrl组相比,LARP7组中LARP7基因表达水平显著升高,差异具有统计学意义,P＜0.05。采用Western-blot方法评估两组LARP7蛋白表达水平,发现与Ctrl组相比,过表达组LARP7蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义,P＜0.05。以上结果说明LARP7过表达细胞株构建成功。4)CCK8实验结果显示,LARP7过表达肺癌细胞OD值明显减低,说明LARP7过表达抑制了肺癌细胞的增殖能力。平板克隆试验显示了过表达LARP7后的A549/H1299细胞的形成的集落数少于对照组的细胞,且差异具有统计学意义（P＜0.001）。以上结果说明过表达LARP7可体外抑制肺癌细胞增殖。5)细胞划痕实验发现LARP7组细胞迁移能力变弱。Transwell小室实验结果显示:过表达LARP7后,穿过小室进入下层的细胞数目变少,说明侵袭能力减弱。划痕实验和Transwell小室实验的实验结果分别表明了,过表达LARP7可以在体外抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力。6)使用流式细胞术Annexin V-PE/7-AAD法检测LARP7及Ctrl组细胞凋亡情况。研究结果显示与Ctrl组细胞相比,过表达LARP7后的A549及H1299细胞凋亡发生率（早期凋亡+晚期凋亡）均显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）。研究结果证明过表达LARP7可以在体外促进肺癌细胞的凋亡。7)监测裸鼠移植瘤生长过程中发现自第19天开始,A549-OE-LARP7组肿瘤的大小明显小于对照组,说明过表达LARP7会抑制体内肺癌组织的生长。与此同时,对最终的肿瘤体积和重量的测量,发现A549-OE-LARP7组的小鼠无论是肿瘤体积还是肿瘤的重量均明显小于对照组,且差异具有统计学意义（P＜0.01）。随后对移植瘤进行免疫组化分析,结果显示LARP7高表达的肿瘤组织中,Ki-67阳性率较低,说明肿瘤组织的增殖能力减弱。以上实验在体内证明了LARP7高表达对肺癌肿瘤的抑制作用。8)RNA-seq分析发现LARP7过表达细胞出现较多基因显著差异表达,且有更多的可变剪接事件发生。DEGs主要富集到免疫炎症相关通路,RASGs主要富集到细胞增殖和凋亡相关生物学过程。将DEGs与RASGs进行交集分析,发现143个重叠基因,其中两个与肺癌密切相关的基因,LARP7组中FN1和ADAR的表达水平明显下调且可变剪切事件发生明显高于Ctrl组。9)挑选出以下发现显著变化的基因:ADAR、FN1、IFI6、IFI27、B2M、BST2、HIST3H2A、SLC45A1以及ARHGAP42,并应用q RT-PCR检测LARP7及Ctrl组差异基因表达量,结果提示LARP7组大多数基因表达量明显下调,与测序结果基本一致。将DEGs与RASGs进行重叠分析,其中FN1及ADAR基因表达水平及可变剪切在LARP7过表达组及Ctrl组均显著差异,且文献报道与肺癌密切相关,我们根据测序数据分析使用IDT网站设计了FN1、ADAR不同剪切体的引物,通过q RT-PCR检测过表达LARP7之后,同一基因两个剪切体之间的变化差异,结果发现在过表达LARP7的A549和H1299细胞中,与引物序列1相比,引物序列2的转录本表达量明显升高,差异具有统计学意义,P＜0.05。这表明过表达LARP7后FN1、ADAR基因发生了更多的可变剪切事件。结论:我们首先通过公共数据库发现了LARP7这个与肺癌进展预后密切相关的RNA结合蛋白,并在单中心样本中进行了验证。而且我们对LARP7在肺癌中的内在机制进行了深入探究。发现LARP7在肺癌肿瘤组织中呈现低表达,体内外实验发现过表达LARP7能明显抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进肿瘤细胞凋亡,并在体内抑制肿瘤生长,而空载体对照不会出现类似效果。机制上,LARP7过表达引起基因显著差异表达及可变剪接,且这些基因主要富集在免疫炎症、细胞增殖凋亡等与肿瘤相关功能通路上,提示LARP7可能通过引起广泛基因差异表达及可变剪接调节肺癌进展。FN1及ADAR基因表达水平及可变剪切在LARP7过表达组及Ctrl组均显著差异,且与肺癌密切相关。LARP7作为RNA结合蛋白,可能结合核仁小分子RNA（sno RNA）等非成熟m RNA前体,导致可变剪切事件发生,影响FN1和ADAR等基因的转录本差异表达,进而造成恶性肿瘤行为的改变。这也可以为相关药物开发提供新的思路。