论文部分内容阅读
目的:在我国,食管胃交界部腺癌(Adenocarcinoma of the Esophagogastric Gunction,AEG)作为常见的恶性肿瘤之一,其死亡率和发病率均在各类恶性肿瘤中位居前列,我省位于太行山脉南段的几个县市发病率和死亡率更是居高不下。近1/3的患者就诊时已属晚期而不能切除,同一p TNM分期的患者预后却不相同,因此从表观遗传学的角度探索肿瘤的发生、发展成为近年来研究的热点。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传特征,其在多种恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用,然而国内关于DNA甲基化与食管胃交界部腺癌关系的研究报道却很少,本试验通过甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)分析食管胃交界部腺癌和癌旁正常组织的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子区甲基化状态,用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)法检测MGMT蛋白表达情况。通过分析MGMT基因甲基化及其蛋白表达情况与食管胃交界部腺癌临床特征及生存时间的相关性,探讨它们与食管胃交界部腺癌诊断、预后的关系,旨在使之成为早期诊断和判断预后的分子标志物。方法:选取2011年1月至2011年12月在河北医科大学第四医院胸外科住院,经左胸行食管胃交界部腺癌根治术的患者107例,患者均依据2013年胃癌规范化诊治指南(试行)中食管胃交界部腺癌的诊断标准经病理诊断为腺癌,年龄在50~75岁,平均年龄63.40±6.64岁,彼此间无亲缘关系,术前无放、化疗病史,无远处转移征象,需排除术后严重并发症、精神疾病无法配合治疗等患者。癌组织取自肿瘤中央非坏死区域的病理石蜡标本,相应距肿瘤边缘5cm以上的临床下残标本作为癌旁正常组织,其性别、年龄等组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。将符合入组条件的107例癌组织和107例癌旁正常组织病理蜡块切为5μm薄片,分别进行DNA的提取。将提取的DNA进行亚硫酸盐修饰,修饰后的DNA用PCR进行MGMT基因的扩增,扩增产物使用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测(见Fig.1)。食管胃交界部腺癌和癌旁的石蜡组织使用DAB显色方法进行MGMT的免疫组化染色,应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP法)免疫组织化学染色检测MGMT蛋白表达情况(见Fig.2,Fig.3)。查阅入选的食管胃交界部腺癌患者手术病例,记录其性别、年龄、病理分期、肿瘤大小、阳性淋巴结数及残端性质等数据,通过电话、书信及门诊调查问卷等方式随访病人化疗史,具体死亡时间,死亡原因等。应用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,两样本率的比较采用χ2检验和Wilcoxon符号秩检验,相关性分析用Spearman相关分析,单因素生存分析采用Kaplan-Meier法,组间比较用Log-rank检验,影响5年生存时间的危险因素采用多因素Cox回归分析。P<0.05为具有统计学意义。结果:1癌组织中MGMT基因启动子区甲基化率(45.8%,49/107)显著高于癌旁正常组织中该基因甲基化率(16.8%,18/107),差异有统计学意义(Z=-4.258,P<0.01);癌组织中MGMT蛋白阳性率为(50.5%,54/107),显著低于癌旁正常组织中蛋白阳性率(81.3%,87/107),差异有统计学意义(Z=-4.533,P<0.01)(见Table 1)。2 49例MGMT基因启动子区出现甲基化的腺癌组织中15例(30.6%)MGMT蛋白表达,58例MGMT基因启动子区非甲基化的腺癌组织中39例(67.2%)MGMT蛋白表达;18例MGMT基因启动子区出现甲基化的癌旁正常组织中5例(27.8%)MGMT蛋白表达,89例MGMT基因启动子区非甲基化的癌旁组织中82例(92.1%)MGMT蛋白表达。经Spearman等级相关分析,癌组织和癌旁正常组织中MGMT基因启动子区甲基化与MGMT蛋白表达差异有统计学意义(P<0.01),两者呈负相关,相关系数r分别为-0.365和-0.618(见Table2)。3 MGMT基因启动子甲基化、MGMT蛋白表达与年龄、性别、残端性质、肿瘤大小之间的关系无统计学差异(P>0.05);MGMT基因启动子甲基化、MGMT蛋白表达与淋巴结转移(P=0.031,P=0.046)、p TNM分期(P=0.012,P=0.022)的关系存在统计学差异(见Table 3)。4入组患者中位生存时间35月,MGMT基因启动子区甲基化患者生存时间26个月(95%CI:19.544~32.456),明显低于未甲基化组患者生存时间44个月(95%CI:38.117~49.883),经Log-rank检验差异有统计学意义(P<0.05)(见Table 4,Fig.4);MGMT蛋白表达患者中位生存时间44个月(95%CI:37.356~50.644),高于蛋白失表达患者的26个月(95%CI:20.672~31.328),经Log-rank检验差异有统计学意义(P<0.05)(见Table 4,Fig.5)。5经多因素Cox回归分析,性别、年龄、残端性质、肿瘤大小、淋巴转移数不能影响食管胃交界部腺癌术后患者5年生存时间(P>0.05),而MGMT基因启动子区甲基化(P=0.027)、MGMT蛋白表达(P=0.031)、化疗史(P=0.031)及p TNM分期(P=0.040)均可影响患者生存时间(见Table 5)。结论:1食管胃交界部腺癌组织中MGMT基因启动子区甲基化与MGMT蛋白表达呈负相关。2 MGMT基因启动子甲基化及蛋白表达与淋巴结转移、p TNM分期相关。3 MGMT基因启动子区甲基化及蛋白表达可影响患者生存时间,可以作为判断食管胃交界部腺癌患者预后的分子标志物之一。