哮喘是常见的肺部疾病之一,其死亡率在我国高达36.7/10万人,居全球首位,其中患有严重哮喘的患者约3%-10%,主要以中性粒细胞浸润为主。目前,临床用于哮喘治疗的药物对中性粒细胞哮喘效果不佳,且大多数具有耐药性或不良反应。氧化应激失衡与中性粒细胞哮喘病理进程息息相关,过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）会降低糖皮质激素在中性粒细胞哮喘中的疗效,同时还能刺激组胺的释放,导致内皮细胞的损伤和脱落、破坏β-肾上腺素能受体的功能,导致气道受损重塑、呼吸阻力增加、肺功能低下。研究表明,靶向中性粒细胞相关介质或中性粒细胞介导的炎症反应是哮喘治疗的新策略。中性粒细胞通过释放DNA、组蛋白和蛋白酶等组装形成的胞外网状结构捕捉杀灭病原体,但过量的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）形成是许多炎症反应和自身免疫性疾病的发病机制。因此,设计并研发安全高效、生物相容性良好、能够靶向至肺部中性粒细胞、兼具活性氧清除和抑制NETs形成的纳米药物可能具有良好的中性粒细胞哮喘防治效果。本课题拟通过抑制中性粒细胞的氧化应激、减少NETs形成来控制局部炎症反应,减轻气道重塑,改善肺功能,从而达到治疗中性粒细胞哮喘的目的。基于此,我们通过将Tempol（Tpl）和苯硼酸频哪醇酯（PBAP）共价连接到环糊精（β-CD）上成功构建了活性氧清除性纳米粒TPCN及线粒体靶向性纳米粒TTPCN。分别考察了TPCN与TTPCN在中性粒细胞哮喘中的靶向效果与治疗作用,并深入探究了其抗中性粒细胞哮喘的作用机制,初步研究发现,抑制NETs形成能够减少其对na（?）ve T细胞的NETs捕获和包裹,对Treg/Th17细胞平衡产生有益影响。方法1.活性氧清除性纳米粒TPCN的构建与表征Tpl被CDI活化后,与β-CD在4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下通过共价键结合得到TCD。随后将经CDI活化的PBAP在DMAP催化下,与TCD共价结合得到活性氧清除性材料TPCD。通过红外光谱（FT-IR）与核磁共振氢谱（1H NMR）分析验证TPCD的结构。通过改良的纳米沉淀/自组装法制备活性氧清除性纳米粒TPCN。以卵磷脂和DSPE-m PEG2000的水溶液为水相,将TPCD的甲醇溶液在剧烈搅拌下逐滴加入到水相中自组装得到TPCN。通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察TPCN的外观并采用粒度仪测定TPCN的粒径分布及表面电位。2.TPCN在中性粒细胞哮喘中的靶向治疗作用评价通过LPS和OVA滴鼻吸入及OVA和Al（OH）3腹腔注射致敏小鼠,OVA激发建立中性粒细胞哮喘模型。通过尾静脉注射和雾化吸入Cy7.5/TPCN,采用活体成像系统探究TPCN在中性粒细胞哮喘肺部的靶向能力。利用Cy5/TPCN,通过流式细胞术分析尾静脉注射和雾化吸入给药后TPCN在肺组织白细胞中的分布。分别按照尾静脉注射和雾化吸入的给药方案给予中性粒细胞哮喘小鼠不同药物治疗。治疗结束后,取肺部灌洗液,检测中性粒细胞含量、氧化应激相关指标H2O2、MPO和炎症因子TNF-α、IL-1β、Il-17、KC水平。取肺组织,进行免疫荧光染色、H&E染色和PAS染色。通过小动物肺功能仪检测小鼠的呼吸阻力。3.线粒体靶向性纳米粒TTPCN在中性粒细胞哮喘中的靶向治疗作用评价通过纳米沉淀/自组装法制备得到不同比例STPP修饰的Cy5/TTPCN并采用粒度仪测定不同纳米粒的粒径分布。尾静脉注射不同比例STPP修饰的Cy5/TTPCN后,采用活体成像技术探究在中性粒细胞哮喘肺部达到最佳靶向性的STPP最优比例。将Cy5/TTPCN与A549细胞和中性粒细胞共孵育后,采用Mito Tracker Green标记细胞线粒体,通过共聚焦显微镜考察TTPCN与线粒体的共定位情况。按照尾静脉注射的给药方案给予中性粒细胞哮喘小鼠TTPCN与TPCN治疗。实验结束后,通过测定肺部灌洗液中中性粒细胞含量和H2O2、MPO、KC、TNF-α、IL-1β水平评价TTPCN的疗效。通过肺部H&E染色与PAS染色观察TTPCN对缓解气道狭窄、抑制粘液分泌和炎性细胞浸润等方面的作用。4.TPCN抗哮喘作用机制研究4.1 TPCN体外生物学效应研究将不同浓度的Cy5/TPCN与A549细胞和中性粒细胞孵育不同时间后,流式细胞术与激光共聚焦显微镜考察细胞对TPCN的摄取。通过流式细胞术与激光共聚焦显微镜考察TPCN对PMA刺激中性粒细胞产生活性氧的抗氧化作用,并进一步探究TTPCN的抗氧化能力。通过ELISA分析TPCN对PMA刺激中性粒细胞分泌TNF-α、KC和IL-1β的抗炎作用。通过Transwell实验探讨TPCN对中性粒细胞迁移的影响。4.2 TPCN对中性粒细胞哮喘肺部转录组基因的调节作用通过基因测序技术分析中性粒细胞哮喘小鼠较正常组与TPCN治疗组的转录组差异基因,并采用q RT-PCR技术验证基因测序结果,为进一步探究TPCN抗哮喘机制提供基因学相关证据。4.3 TPCN体外抑制中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的作用研究将不同浓度TPCN与中性粒细胞孵育后,加入PMA刺激中性粒细胞产生NETs。通过荧光法、ELISA和WB测定NETs主要成分（ds DNA、NE、MPO和cit H3）含量变化。进一步采用激光共聚焦显微镜观察TPCN体外抑制NETs形成的作用。4.4 TPCN体内抑制NETs形成的作用研究通过给予中性粒细胞哮喘小鼠不同剂量的TPCN治疗后,分别提取肺部灌洗液和肺组织。通过荧光法和ELISA测定肺部灌洗液中ds DNA与NE的含量,采用WB和激光共聚焦显微镜考察cit H3和NE在小鼠肺组织中的表达。4.5 TPCN调节中性粒细胞哮喘体内的免疫失衡中性粒细胞哮喘小鼠在给予生理盐水与TPCN治疗后,处死小鼠,取肺组织和脾脏。通过消化研磨肺组织和脾脏,提取得到单细胞悬液,并采用流式细胞仪检测Treg细胞和Th17细胞。4.6 TPCN通过抑制NETs形成调节Treg细胞分化的作用及机制研究将提取的na（?）ve CD4+T细胞在Treg细胞分化条件下分别与中性粒细胞和NETs共孵育并进行Treg细胞染色,通过流式细胞仪检测NETs对Treg细胞分化的影响。将TPCN与PMA刺激的中性粒细胞共孵育后,加入na（?）ve CD4+T细胞并在Treg细胞分化条件下继续培养,行Treg细胞染色并采用流式细胞仪检测。另外,将培养后的细胞固定脱水喷金后,通过扫描电子显微镜观察NETs对T细胞的包裹作用。5.TPCN与TTPCN的初步生物安全性评价将不同浓度的TPCN和TTPCN与A549细胞孵育不同时间后,CCK8检测细胞活性。Balb/c雌性小鼠连续7天分别雾化吸入50 mg/kg和100 mg/kg的TPCN后,监测体重变化并于一周后取外周血及主要脏器,检测血常规和肝肾功,脏器进行H&E染色。将肺组织研磨后,测定H2O2、MPO、TNF-α和IL-1β的含量。将TPCN分别与PMA刺激的中性粒细胞和中性粒细胞哮喘小鼠肺组织匀浆液共孵育,通过核磁共振仪和MADLI-TOF检测水解产物。结果1.通过核磁氢谱和红外光谱确证了TPCD的成功合成。由TPCD制备的TPCN呈边缘规则,大小形态均一的球形,平均粒径为80 nm,表面电位平均为-19 m V。2.通过尾静脉注射和雾化吸入后,TPCN能在中性粒细胞哮喘小鼠肺部达到有效蓄积,并被肺部中性粒细胞特异性摄取。在中性粒细胞哮喘模型中,TPCN显著降低肺泡灌洗液中ROS和MPO水平及中性粒细胞含量。同时,TPCN能够有效抑制多种炎症因子的分泌。此外,TPCN可减轻肺组织水肿、炎性细胞浸润、粘液分泌和气道阻力。3.经过线粒体靶向单元修饰后,纳米粒在中性粒细胞哮喘肺部的靶向能力得到了显著性提高。激光共聚焦显微镜观察到TTPCN与细胞线粒体的良好共定位。在中性粒细胞哮喘模型中,与TPCN相比,TTPCN能更有效降低肺泡灌洗液中ROS、KC、TNF-α、IL-1β和MPO的含量及中性粒细胞含量。H&E和PAS染色也显示TTPCN具有更好的疗效。4.在细胞水平,TPCN能够被A549细胞和中性粒细胞有效摄取,并呈现时间和浓度依赖性。TPCN能显著抑制PMA诱导的中性粒细胞内ROS生成,并降低促炎细胞因子KC、TNF-α和IL-1β的过表达。与TPCN共孵育后,中性粒细胞的迁移能力明显减弱。另外,与TPCN相比,TTPCN抑制中性粒细胞内ROS产生的能力更优。5.基因测序结果显示:与正常小鼠相比,中性粒细胞哮喘小鼠肺组织中与NETs密切相关的Elane和Mpo基因均显著上调,经TPCN干预后两者可恢复正常。并进一步通过q RT-PCR得以证实。6.在细胞水平,PMA刺激中性粒细胞后,NETs的特征成分ds DNA、NE、MPO和cit H3的含量显著升高,而TPCN干预后可显著降低这些成分的表达水平,并呈现一定的剂量依赖性。此外,激光共聚焦显微镜观察到中性粒细胞释放的胞外ds DNA和cit H3呈纤维状。相比之下,TPCN可显著降低NETosis程度和cit H3面积。7.动物实验表明,中性粒细胞哮喘小鼠肺部灌洗液中ds DNA和NE含量及肺组织中NE和cit H3水平显著高于正常小鼠。然而,经TPCN治疗后,肺泡灌洗液和肺组织中ds DNA、NE和cit H3表达明显降低。与正常小鼠相比,中性粒细胞哮喘小鼠肺和脾中Treg细胞计数明显下降,Th17细胞含量升高,Treg/Th17细胞比例显著降低。TPCN治疗后,Treg细胞升高,Th17细胞下降,有效恢复了Treg/Th17细胞的比例。8.细胞实验表明,NETs显著抑制了na（?）ve T细胞向Treg细胞的分化,而正常中性粒细胞对Treg细胞分化没有明显影响。TPCN通过减少NETs形成恢复Treg细胞分化。扫描电镜观察到na（?）ve T细胞被NETs完全覆盖,但TPCN可显著减少T细胞表明的NETs涂层。9.体外初步的安全性实验表明,即使是高剂量的TPCN和TTPCN,对A549细胞也没有明显的细胞毒性。体内实验表明,雾化吸入大剂量的TPCN后,小鼠的体重增长、脏器指数和血常规等没有明显改变,主要脏器未见明显微结构破坏或炎性细胞浸润。此外,肺组织中H2O2、MPO、TNF-α和IL-1β水平未见异常变化。TPCN在PMA诱导的中性粒细胞和中性粒细胞哮喘小鼠肺组织匀浆液中水解代谢生成了β-CD和其他水溶性分子。结论1.由β-CD、Tpl和PBAP成功构建了活性氧清除材料TPCD,并制备了活性氧清除性纳米粒TPCN。2.TPCN可特异性分布于中性粒细胞哮喘小鼠肺部中性粒细胞中。在中性粒细胞哮喘中,TPCN通过尾静脉注射和雾化吸入后均表现出良好的治疗作用:减轻氧化应激和炎症反应,抑制粘液高分泌,逆转气道重塑和改善肺功能。3.使用线粒体靶向单元进行表面修饰后,TTPCN在中性粒细胞哮喘中的肺部靶向能力和体疗效显著增强。4.通过对TPCN抗中性粒细胞哮喘作用机制的研究发现,TPCN可显著抑制中性粒细胞的氧化应激、炎症反应与细胞迁移。同时,TPCN可有效抑制NETs形成,调节Treg/Th17细胞平衡维持免疫稳态。此外,TPCN可通过减少NETs对na（?）ve T细胞的包裹和抑制NETs中DNA/蛋白质成分对T细胞的不利影响调节恢复NETs所导致的Treg细胞分化减少。5.在体内外安全性实验中,TPCN均表现出良好的生物安全性综上所述,本研究表明通过纳米疗法介导中性粒细胞氧化应激和炎症反应精确抑制NETosis和促进免疫内稳态是防治中性粒细胞哮喘的可靠策略。此外,鉴于中性粒细胞的重要病理作用,ROS-NETs-Treg/Th17通路可能成为治疗严重哮喘和其他中性粒细胞炎症相关的感染性和非感染性肺部疾病的新靶点,如成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺炎、囊性纤维和COVID-19。