心脏病是影响人类健康的主要疾病之一,其具有高发病率和致死率的特点。目前药物疗法因使用方便,依从性好被认为最具前景的治疗方式,但同时也面临诸多困难,如常规治疗药物保留时间短,心脏组织分布低,治疗效果不佳。且心脏局部注射和经心包、冠状动脉注射等给药方式因侵入性、分布难以控制、可重复性差而应用受限。因此,构建靶向性好、依从性强、使用简单的新型制剂对于心脏病的治疗意义重大。随着纳米技术与药学学科的加速融合,新型纳米递送系统的涌现为心脏药物递送提供了新的策略,但同时也面临着诸多困难,如在递送效率、质量控制、制造再现性和可扩展性等方面存在的问题使得心脏靶向纳米疗法的工程设计仍面临重大挑战,构建优良的工程化纳米药物制备体系意义重大。多酚化合物被证明对心肌细胞和组织具有高度亲和力,且多酚羟基被证实与含羰基材料能够通过氢键作用稳定结合。因此本课题设计通过多酚化合物辅助的纳米沉淀/自组装方法,期望构建心脏靶向药物的工程化纳米制备平台,通过参数得到系列纳米粒,系统表征其粒径、形态和稳定性。同时在体内外心肌损伤模型中验证基于该平台筛选的生物活性纳米粒经静脉注射后的心脏靶向能力和治疗心脏病作用。方法1.活性氧（ROS）响应性材料OCD和ROS清除性材料TPCD的合成及表征4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）与β环糊精（β-CD）键合得到氧化响应性材料OCD。将Tempol（Tpl）与PBAP先后键合到β-CD得到ROS清除性材料TPCD。利用红外光谱、核磁氢谱和质谱分析产物结构。2材料体外清除ROS能力评价通过DPPH·清除实验来考察多酚化合物和载体材料清除自由基的能力;利用相应试剂盒测定材料对超氧阴离子和过氧化氢的清除能力。3.基于多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒的构建以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、OCD和TPCD作为代表性的载体材料,没食子酸（GA）,儿茶素（CAT）,表没食子儿茶素没食子酸酯（EG）和鞣酸（TA）作为具有不同数量酚羟基的典型多酚化合物,通过改变载体/多酚化合物质量比、多酚化合物种类和有机溶剂类型得到系列纳米粒。系统表征并评价其在不同介质中稳定性。利用银沉淀实验、BCA定量实验、红外光谱、X射线光电子能谱（XPS）和不同介质中粒径变化,确认纳米粒表面的多酚修饰及其形成初步机制。4.生物活性纳米粒响应性水解及ROS清除能力评价将纳米粒与不同浓度H2O2共孵育,通过观察纳米粒形貌和测定溶液吸光度,评价纳米粒响应性水解能力。并分别利用相应试剂盒测定纳米粒对羟基自由基、超氧阴离子、过氧化氢的清除能力。5心肌细胞对生物活性纳米粒吞噬能力评价将不同浓度Cy5荧光标记的TPCD-TA纳米粒（TPTN）与正常或损伤大鼠H9C2心肌细胞孵育不同时间,利用激光共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术探究心肌细胞对生物活性纳米粒的吞噬能力。6.生物活性纳米粒细胞水平抗氧化、抗炎效应评价分别利用Co Cl2诱导大鼠心肌细胞缺氧/缺血损伤模型,异丙肾上腺素（ISO）诱导大鼠心肌细胞肥大模型。CLSM和流式细胞术分析TPTN对细胞内ROS水平影响,测定细胞内H2O2和丙二醛（MDA）以及培养上清液中的肿瘤坏死因子（TNF）-α和心肌肌钙蛋白（c Tn）-I的水平。7.生物活性纳米粒在心脏骤停复苏后大鼠和心肌肥大小鼠心脏靶向性研究经食道电刺激诱发VF,建立大鼠心脏骤停复苏后心肌损伤模型;通过异丙肾上腺素皮下注射诱导小鼠心肌肥大模型。利用活体成像仪分析模型鼠不同时间血和心脏Cy7.5/TPTN荧光强度。另外利用CLSM观察心脏冰冻切片中Cy5/TPTN分布。8.生物活性纳米粒对心脏骤停后复苏大鼠治疗作用评价监测TPTN对心脏骤停复苏后心肌损伤模型大鼠MAP、心功能和心电图影响,对大鼠进行神经功能评分和生存状态评价。通过心肌切片评估心肌损伤和心肌纤维化。另外,检测心脏H2O2、MDA、TNF-α和白介素（IL）-6的水平以及血清中的c Tn-I和肌酸激酶（CK）。9.生物活性纳米粒对心肌肥大小鼠治疗作用评价使用超声心动图评估TPTN治疗对心肌肥大小鼠心室壁厚度和心功能影响。观察心脏大小,测定心脏指数。通过心脏切片染色观察组织纤维化程度。另外,分别测量心脏中H2O2,MDA,TNF-α和IL-6的水平以及血清c Tn-I,脑钠肽（BNP）水平。10.生物活性纳米粒初步安全性评价通过CCK-8细胞毒性试验、溶血试验和心肌肥大小鼠在不同治疗剂量TPTN作用下体重变化、脏器指数、血常规以及肝肾功变化,评价纳米粒体内外安全性。结果1.一个β-CD分子键合约5个PBAP得到氧化响应性材料OCD。一个β-CD分子键合约2个Tpl和5个PBAP得到材料TPCD。2.基于多酚化合物表面自组装构建出系列生物活性纳米粒,纳米粒在去离子水、PBS或胎牛血清等介质中均具有良好的稳定性。通过银沉积法、BCA定量分析、XPS和FT-IR证实了纳米粒上TA的修饰。同时XPS、FT-IR和不同介质中粒径变化证明载体材料和多酚化合物通过氢键作用稳定结合。3.体外ROS清除实验证实,基于多酚化合物表面自组装构建的纳米粒具有良好的ROS清除能力,其中OCD-TA和TPCD-TA纳米粒显示出ROS响应性水解能力。4.体外生物活性评价表明,基于多酚化合物表面自组装构建的活性纳米粒TPTN可被正常和损伤心肌细胞有效吞噬,从而在Co Cl2刺激制备的缺氧缺血性损伤的细胞模型和ISO诱导的心肌细胞肥大模型中抑制氧化应激,减弱炎症反应,从而发挥心肌细胞保护作用。5.心脏靶向性实验发现,Cy7.5/TPTN在心脏骤停复苏后心肌损伤大鼠和心肌肥大小鼠心脏荧光强度明显高于健康鼠,且模型鼠离体心脏的荧光强度存在蓄积现象。在心脏冰冻切片中观察到Cy5/TPTN荧光在心肌区域的明显分布。这些结果证实TPTN纳米粒通过静脉注射给药具有明显的心脏靶向性。6.在心脏骤停复苏后心肌损伤大鼠靶向治疗实验中,TPTN可显著提高模型大鼠存活率,提高动脉血压和左心室射血分数,改善心电状态和神经功能,降低心肌组织中氧化介质、促炎性细胞因子和血清心肌损伤因子的表达水平。心肌组织切片证实TPTN可改善心肌细胞损伤和胶原蛋白沉积。7.在心肌肥大小鼠治疗实验中,TPTN可减少心室扩张,改善射血分数,降低心脏指数、心脏中氧化介质、促炎性细胞因子以及心肌损伤血清标志物c Tn-I和BNP的水平,有效抑制模型小鼠心肌纤维化。8.TPTN不影响细胞活力,不会发生溶血现象。在心肌肥大小鼠的治疗过程中,未观察到明显的体重减轻或行为异常变化,主要器官的器官指数和肝肾功与对照小鼠相比无明显差异。结论1.基于多酚化合物表面自组装,构建出心脏靶向的生物活性纳米粒制备平台,通过改变载体材料/多酚化合物的重量比、多酚化合物类型和有机相等参数,可制备具有所需理化性质的纳米粒,经系统表征表明其粒径均一,形态饱满,状态稳定。2.经心脏靶向的工程化纳米制备平台筛选的多酚化合物表面自组装纳米粒TPTN,具有稳定的理化性质、良好的ROS响应性和强大的ROS清除能力。TPTN在细胞水平可被大鼠心肌细胞有效吞噬后保护细胞免受Co Cl2诱导的缺氧缺血性损伤和ISO刺激的心肌肥大损伤。3.活体成像和激光共聚焦观察表明负载荧光的TPTN经静脉注射可靶向富集在心肌损伤部位。在体内心肌损伤动物模型中证明其显著减轻氧化应激,抑制炎症反应从而减少心肌损伤,有效改善心肌功能障碍。4.初步的体内外安全性实验证实了多酚化合物表面自组装纳米粒TPTN的良好安全性。