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1研究背景在临床上,急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury, ALI/acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一种常见危重疾病,其病死率在我国仍居高不下,高达50%-70%,主要原因是除机械通气外尚未发现有效的治疗措施。各种非心源性疾病如严重烧伤、感染、休克等,可继发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),病情进展快,如处理不及时,可发展成为多器官功能障碍综合征(multiple system organ dysfunction, MODS)。急性肺损伤是SIRS在肺部的表现,其病理生理过程的实质是炎症反应过度放大及氧化应激反应过度激活的过程,炎症失衡诱发大量活性氧生成,活性氧生成导致肿瘤坏死因子.a(Tumor Necrosis Factor -α, TNF-α)等炎症因子生成增加,导致弥漫性的肺间质及肺泡上皮细胞水肿,引起严重的低氧血症,迅速导致呼吸衰竭,其严重阶段即为急性呼吸窘迫综合征。TNF-a作为ALI/ARDS病理生理过程中主要的炎性介质之一,能介导放大炎症反应,同时能介导内皮细胞及中性粒细胞产生大量的活性氧(Reactive Oxidative Species, ROS),打破氧化.抗氧化系统平衡,最终引起肺组织细胞凋亡和坏死,严重影响患者病情程度及临床预后。众多研究表明过度放大的炎症反应及氧化应激反应所致广泛的肺泡上皮细胞凋亡是ALI的重要发病学基础。过度凋亡不仅引起结构细胞数量减少,同时使肺组织病理变化加重；另外在ALI病理变化过程中需将受损的结构细胞清除,此过程可能引起炎症反应而加重己存在的肺损伤。细胞凋亡是细胞在一定生理或病理条件下,发生的自身程序性死亡,对机体稳定和生长发育具有重要的意义[9]。细胞凋亡途径主要分为外源性凋亡途径和内源性凋亡途径,其中Bcl2家族成员在细胞凋亡的基因调控过程中起着十分重要的作用,根据功能主要分为两大类,一类是抗凋亡蛋白,包Bcl2、Bcl-xl、Bcl-w等,另一类是促细胞凋亡蛋白,包括Bax、Bad、Bim等。FOXO属于FOX家族的一个亚群,含有高度保守的DNA结构域,即Forkhead结构域,包括螺旋.转角.螺旋模体,3个α螺旋及2个大环构成的翅膀状结构。FOXO在哺乳动物中存在FOXO1、FOXO4、FOXO3a,和FOXO6共4个亚型,FOXO6与其他三个FOXO蛋白一样有着高度的保守性,但是缺少C端的PKB磷酸化位点。FOXOs在细胞分化、代谢、肿瘤发生、骨骼肌发育等过程中起重要作用。FOXOs的分布具有组织特异性,其中FOXO1在脂肪组织、骨骼肌及肺组织等表达程度较高[13]。目前较多研究表明FOXOs对细胞凋亡过程存在调控作用。FOXO3a与ROS介导的小鼠未分化脂肪细胞凋亡存在关联,通过调节凋亡相关基因Bim的表达参与细胞凋亡过程。FOXOs可作为转录因子直接或协同其他的转录因子间接参与基因转录的调节,在氧化应激及细胞凋亡中起着重要作用。研究表明FOXOs高表达抑制细胞生长,当细胞浆FOXOs转位至细胞核时,将使细胞凋亡增加。FOXOs作为重要的细胞凋亡调节因子是否参与ALI过程仍不清楚。在成骨细胞过度的炎症反应中,FOXO1参与介导细胞凋亡[17]。而另一项研究表明TNF-α刺激脂肪细胞能介导促炎因子MCP-1、IL-6表达的增加,同时能上调Akt依赖的FOXO1活性,细胞凋亡水平增加[18]。故我们推测FOXO1可能在ALI肺泡上皮细胞凋亡过程中具有重要作用,鉴此,本研究拟通过构建ALI细胞炎症模型,采用基因重组技术和RNAi干扰技术深入研究FOXO1对肺泡上皮细胞凋亡的作用及作用机制,以期为ALI/ARDS提供救治新方案及救治依据。2研究目的(1)通过基因重组技术,探讨验证增强FOXO1表达在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用及对凋亡相关基因bcl2/Bax、Bim的影响。(2)通过RNAi干扰技术,探讨验证沉默FOXO1表达在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用及对凋亡相关基因bcl2/Bax、Bim的影响。3方法和材料肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞由广州军区广州总医院医学实验科细胞库提供。A549细胞在含10%灭活小牛血清F12K培养基中,置于37℃,5%C02饱和湿度条件下的培养箱中培养。3.1增强FOXO1表达在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用及其作用机制探讨3.1.1增强FOXO1表达对TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响A549细胞分为四组：空白对照组(不加任何干预因素)、TNF-α刺激组(仅予重组人TNF-α刺激)、FOXO1组(预转染GV230-FOXO1质粒并予重组人TNF-α刺激)、阴性对照组(预转染GV230空质粒并予重组人TNF-α刺激)。采用2%血清浓度培养基饥饿细胞8小时,质粒转染6小时后继续予2%血清浓度培养基培养10小时,然后予TNF-α刺激24小时。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。3.1.2增强FOXO1表达对凋亡相关基因bcl2/Bax、Bim表达的影响实验分组同上。RT-PCR检测bcl2/Bax、Bim mRNA水平。Western Blot检测bcl2/Bax、Bim蛋白水平。3.2 RNAi干扰FOXO1表达在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用及其作用机制探讨3.2.1 siRNA沉默FOXO1对TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响实验分组：将Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞分为四组：空白对照组(不加任何干预因素)、TNF-α刺激组(仅予重组人TNF-α刺激)、FOXO1siRNA组(预转染FOXO1siRNA并予重组人TNF-α刺激)、阴性对照组(预转染阴性对照siRNA并予重组人TNF-α刺激)。采用2%血清浓度培养基饥饿细胞18小时,siRNA转染6小时后,予TNF-α刺激24小时。采用流式细胞仪检测各组细胞细胞凋亡率。3.2.2 siRNA沉默FOXO1对凋亡相关基因bcl2/Bax、Bim表达的影响实验分组同上。RT-PCR检测bcl2/Bax、Bim mRNA水平。Western Blot检测bcl2/Bax、Bim蛋白水平。3.3统计学方法采用spss20.0软件进行统计学的分析,计量资料以均数±标准差(X±S)表示。各组数据均先进行方差齐性检验,组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA).方差时,多重比较采用LSD检验,方差不齐时,多重比较采用Dunnett’s T3检验,P<0.05差异有统计学意义。4结果4.1增强FOXO1表达在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用及其作用机制探讨4.1.1增强FOXO1表达对TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响TNF-α组、FOXO1组、阴性对照组细胞凋亡率明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)；FOXO1组细胞凋亡率明显高于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.1.2增强FOXO1表达对bcl2/Bax、Bim mRNA表达水平的影响TNF-α组、FOXO1组、阴性对照组bcl2/Bax mRNA水平明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)：FOXO1组明显低于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α组、FOXO1组、阴性对照组Bim mRNA水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05); FOXO1组明显高于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.1.3增强FOXO1表达对bcl2/Bax、Bim蛋白表达水平的影响TNF-α组、FOXO1组、阴性对照组bcl2/Bax蛋白水平明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05); FOXO1组明显低于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α组、FOXO1组、阴性对照组Bim水平蛋白明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05); FOXO1组明显高于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2 RNAi干扰FOXO1表达在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用及其作用机制探讨4.2.1 siRNA沉默FOXO1表达对TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响TNF-α组、阴性对照组细胞凋亡率明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)；FOXO1si组细胞凋亡率明显低于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2.2沉默FOXO1表达对bcl2/Bax、Bim mRNA表达水平的影响TNF-α组、FOXO1si组、阴性对照组bcl2/Bax mRNA水平明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05); FOXO1si组明显高于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α组、阴性对照组Bim mRNA水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05); TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05); FOXO1si组明显低于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2.3沉默FOXO1表达对bcl2/Bax、Bim蛋白表达水平的影响TNF-α组、FOXO1si组、阴性对照组bcl2/Bax蛋白水平明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)：FOXO1si组明显高于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α组、阴性对照组Bim蛋白水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05); FOXO1si组明显低于TNF-α组及阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。5结论FOXO1在TNF-α诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中起促进细胞凋亡的作用,其可能通过上调促凋亡相关基因Bim的表达、下调凋亡相关基因bcl2/Bax的比值,参与细胞凋亡过程。