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肠纤维化所致肠腔狭窄、肠梗阻是炎症性肠病常见并发症,其中,上皮间质转化（EMT）是肠纤维化形成的重要机制。在此过程中,上皮细胞失去细胞极性及细胞间连接,上皮细胞标志物如E细胞钙黏蛋白（E-cadherin）逐渐消失,而间质细胞标志物如成纤维细胞特异蛋白1（FSP1）逐渐增多。EMT的发生与多种细胞因子、蛋白分子、微环境等有关,涉及到庞大的细胞信号传导途径和复杂的基因调控过程,其中TGF-β/Smad3通路是最为经典且重要的EMT通路。肿瘤坏死因子样配体1A（TL1A）是肿瘤坏死家族（TNF）成员,其受体死亡受体3（DR3）主要表达在CD4+T淋巴细胞、NK细胞和CD8+T淋巴细胞上,近年发现DR3在上皮细胞也有表达,二者结合可启动一系列免疫反应并产生多种炎症因子如TNF-α、IL-17、IFN-γ等。有研究表明TL1A及其受体在炎症性肠病患者肠黏膜及血清中表达升高。高表达TL1A转基因小鼠其自发性的小肠炎症与升高的IL-13相关,另有研究表明,IL-13的表达变化可作用TGF-β1、STAT6,甚至micRNA进而影响上皮间质转化,那么TL1A能否通过与其受体结合或分泌致纤维化因子IL-13进而诱导肠纤维化过程中EMT的发生尚无研究报道。本实验通过检测UC及CD相关肠纤维化患者肠黏膜组织TL1A表达水平以及上皮间质转化相关指标变化,探究其间的相关性。并进一步采用淋系细胞高表达TL1A转基因小鼠和野生型小鼠构建DSS诱导的慢性实验性结肠炎相关肠纤维化模型,探讨在肠纤维化形成过程中TL1A对EMT的影响及其机制,同时应用TL1A体外刺激HT-29细胞,观察细胞形态及标志物的变化情况,以期为慢性结肠炎肠纤维化的防治提供新的理论依据。具体实验分为以下三部分:第一部分TL1A参与IBD相关肠纤维化患者肠黏膜上皮细胞发生上皮间质转化目的:探讨在IBD相关肠纤维化患者中肠黏膜TL1A的表达水平与EMT相关指标的相关性。方法:研究共纳入了UC相关肠纤维化患者12人、CD相关肠纤维化患者10人以及对照组8人。首先通过H&E染色、天狼猩红染色和马松染色对组织标本进行炎症及纤维化程度评估,同时应用免疫组织化学方法测定各组中TL1A及EMT相关指标（E-cadherin,FSP1,α-SMA）的表达情况,并进一步分析TL1A与纤维化程度以及EMT相关指标的相关性。最后通过免疫组织化学方法检测各组结肠黏膜致纤维化因子IL-13、TGF-β/Smad3通路蛋白以及EMT相关转录分子Snail1、ZEB1的表达水平,并与TL1A表达量进行相关性分析。结果:与对照组比较,UC及CD相关肠纤维化组患者血清学炎症指标升高,并且可见结肠黏膜炎症及纤维化。同时UC及CD相关肠纤维化组患者结肠黏膜TL1A表达量显著升高,进一步行相关性分析表明TL1A的升高与纤维化程度、间质标记物FSP1、α-SMA呈正相关,与上皮标志物E-cadherin呈负相关。与对照组相比,免疫组织化学染色显示UC组及CD组患者结肠黏膜IL-13、TGF-β1、Smad3、Snail1以及ZEB1表达升高,并且TL1A表达与EMT相关转录分子呈正相关。结论:TL1A与IBD患者肠纤维化发生呈正相关,并且可能通过TGF-β/Smad3通路参与肠纤维化中上皮间质转化发生。第二部分TL1A促进慢性结肠炎相关肠纤维化中上皮间质转化发生目的:探讨TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠相关肠纤维化形成过程中上皮间质转化的影响以及对HT-29细胞上皮间质转化的影响。方法:将淋系细胞高表达TL1A的转基因（Transgenic,Tg）小鼠与C57BL/6野生型（Wild type,WT）小鼠分为四组:Control/WT组,DSS/WT组,Control/Tg组,DSS/Tg组。Control组小鼠饮用蒸馏水,DSS组小鼠饮用2%DSS水。实验期间,记录小鼠体重变化及大便情况,进行疾病活动指数评分（DAI）。造模结束后,评估小鼠结肠炎症和纤维化情况,并应用免疫荧光双染法检测E-cadherin+FSP1+的表达情况,同时应用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western Blot检测上皮标志物E-cadherin和间质标志物FSP1以及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况。并同时以不同浓度TL1A对HT-29细胞在不同时间点进行干预,应用CCK-8法测定细胞增殖率,应用免疫荧光双染法以及Western Blot检测EMT相关分子表达,以评估TL1A对HT-29细胞的作用。结果:与Control组相比,DSS组小鼠炎症更重,体重下降更明显,DAI评分及结肠组织MPO含量更高,H&E染色可见更多的隐窝破坏,炎细胞浸润,并且与DSS/WT组比较,DSS/Tg组小鼠结肠炎症更甚。与Control组相比,DSS组小鼠结肠长度缩短,胶原纤维沉积更明显,与DSS/WT组比较,DSS/Tg组小鼠结肠纤维化程度更重。免疫荧光染色显示,与Control组相比,DSS组小鼠结肠E-cadherin+FSP1+的平均光密度值升高,并且与DSS/WT组比较,DSS/Tg组小鼠结肠E-cadherin+FSP1+阳性表达更多。同时免疫组织化学染色、Western Blot以及RT-PCR结果均显示,与Control组相比,DSS组小鼠结肠E-cadherin蛋白及mRNA水平均下降,其中DSS/Tg组下降更为明显;与之相反,结肠组织间质标志物FSP1以及α-SMA蛋白含量及mRNA水平升高,并且DSS/Tg组上升更为明显。CCK-8结果显示以50 ng/m L TL1A干预HT-29细胞48h时细胞增殖率最高。免疫荧光染色及Western Blot结果显示,与Control组相比,TL1A可促进HT-29细胞上皮标志物E-cadherin减低,间质标志物FSP1、α-SMA表达升高。结论:DSS可促进小鼠肠道炎症发生,以及胶原沉积,纤维化形成;上皮间质转化是肠纤维化形成过程中的重要机制;TL1A可能通过上皮间质转化促进慢性实验性结肠炎小鼠肠纤维化形成,并且TL1A可在体外促进HT-29细胞系发生上皮间质转化。第三部分TL1A促进慢性结肠炎相关肠纤维化中上皮间质转化的机制研究目的:探讨TL1A促进慢性结肠炎相关肠纤维化中上皮间质转化的作用机制。方法:动物实验分组同前。应用免疫组织化学染色、Western Blot以及RT-PCR方法检测结肠组织中TGF-β/Smad3通路蛋白及mRNA,EMT相关转录分子Snail1、ZEB1蛋白及mRNA表达水平。同时应用ELISA检测动物血清中IL-13和TGF-β1表达含量并进行相关性分析。将HT-29细胞分为以下五组进行干预:Control组,TL1A组,TL1A+TL1A Ab组,TL1A+BMP-7组以及TL1A+TL1AAb+BMP-7组,应用免疫荧光及Western Blot检测EMT相关标志物、TGF-β/Smad3通路蛋白以及EMT转录分子Snail1、ZEB1的表达水平。结果:在实验性结肠炎小鼠中,DSS组小鼠IL-13、TGF-β/Smad3通路蛋白、Snail1以及ZEB1蛋白含量及mRNA水平表达升高,并且血清中IL-13、TGF-β1表达升高,尤以DSS/Tg组为甚。HT-29细胞经TL1A干预后,可发生上皮间质转化,同时此过程可被TL1AAb和/或BMP-7抑制。结论:TL1A可能通过直接与DR3结合或间接分泌IL-13以干预TGF-β/Smad3通路进而影响EMT相关转录因子Snail1以及ZEB1表达。TL1A可以诱导HT-29细胞发生上皮间质转化,该过程可被抗TL1A抗体和/或BMP-7蛋白阻断。