微量金属元素（如锌、锰、钼、钴、铜、镍等）是微生物生长过程中需要量很低但必不可少的一类物质,为微生物细胞物质基础的重要组成部分,在机体中发挥多种生理功能,主要表现为参与构成酶活中心、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、控制细胞氧化还原电位等。生态环境中微量金属元素的种类及含量对微生物的生长有要影响,适宜浓度下,这些微量元素对细胞发挥有益作用,但高浓度会导致细胞毒性。为了生存,细菌演化出一套完备的“金属离子稳态”机制,它通过对微量金属元素的识别、摄取和外排体系,严格调节细胞对微量元素吸收、利用和储存从而维持体内合适的离子浓度。深入了解金属离子稳态机制是研究细菌环境适应性的理论基础,对有益微生物的实际应用和功能发挥具有重要价值。蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 0-9是一株从健康小麦根中分离的革兰氏阳性细菌,对小麦尖斑病、全蚀病等土传病害具有生物防治作用。实验室前期研究发现,该菌中锰感应调节因子MntR蛋白在锰金属离子稳态中发挥重要作用。为了揭示该蛋白在影响蜡样芽孢杆菌对钴/镍金属离子敏感性的作用机制,首先通过分子生物学方法,以ΔmntR为出发菌株,构建互补菌株ΔmntR::mntR,并测定不同培养条件下0-9野生型、基因mntR缺失及互补菌株对钴/镍的敏感性,结果显示无论液体还是固体培养条件下,ΔmntR菌株在钴/镍胁迫下生长均受抑制,而基因mntR互补后可缓解菌株生长的抑制,恢复至接近野生型生长状态,这一结果表明,锰感应调节因子MntR对蜡样芽孢杆菌0-9的钴/镍敏感性具有调控作用。为了了解MntR在蜡样芽孢杆菌0-9中对钴和镍敏感性的调控方式,通过转录组测序筛选差异表达基因,结果发现,mntR基因缺失后,锰超氧化物歧化酶编码基因sodA2的表达量显著上调,转录水平为野生型的168倍。利用DNA同源重组等分子生物学技术构建sodA2基因敲除、互补及超表达菌株,对这些菌株进行金属离子胁迫试验鉴定sodA2基因功能,发现在高浓度的钴离子（0.63 mM）和镍离子（1.9 mM）存在下,各菌株生长能力由强到弱依次为:突变株ΔsodA2、超表达菌株ΔsodA2（p ADxyl-sodA2）（无木糖诱导）、超表达菌株ΔsodA2（p ADxyl-sodA2）（木糖诱导）,即基因sodA2表达量越低,菌株生长越好,表明sodA2基因的缺失降低菌株对高浓度钴/镍敏感性,这与ΔmntR对高浓度钴/镍敏感的表型相反,以上结果暗示锰感应调节因子MntR可能通过对基因sodA2的负调控方式,调节蜡样芽孢杆菌0-9对钴/镍的敏感性。为了验证这一推测,我们用转录融合和凝胶迁移实验测定基因sodA2的表达动态以及与MntR蛋白的结合方式。将绿色荧光蛋白编码基因gfp与sodA2启动子融合表达,构建转录融合载体PsodA2-gfp,分别转化野生型0-9和ΔmntR突变株中,测定荧光信号强度并以此反应sodA2的表达动态,结果显示mntR缺失后,基因sodA2表达量升高。克隆基因并体外表达获得MntR蛋白,同时扩增sodA2启动子序列,二者孵育后进行凝胶迁移实验,发现sodA2的启动子可以与MntR蛋白直接结合。由此表明锰感应调节因子MntR通过与启动子直接结合的方式,负调控基因sodA2表达,使sodA2转录水平下降。在明确基因sodA2参与蜡样芽孢杆菌0-9钴/镍敏感性的基础之上,对sodA2进行基因克隆、表达及产物鉴定。PCR扩增获得sodA2基因DNA启动子,插入质粒构建原核表达载体p ET28a-sodA2,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,并进行蛋白诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化获得SodA2蛋白,测定SodA2蛋白具有超氧化物歧化酶活性,与基因注释“superoxide dismutase（Mn）”一致。综上,本论文通过对生防细菌0-9锰感应调节因子MntR和基因sodA2的功能研究,初步探索了细菌中镍/钴金属离子稳态机制。研究结果表明,细菌通过锰感应调节因子MntR与锰超氧化物歧化酶编码基因sodA2启动子序列直接结合的方式,负调控基因sodA2表达,调节蜡样芽孢杆菌0-9对钴/镍的敏感性,以此应对环境中高浓度金属胁迫。本研究对生防细菌的生态环境适应及生存具有重要意义。