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研究背景:糖尿病神经病理性疼痛（diabetic neuropathic pain,DNP）的发病机制目前尚不清楚且治疗并不理想,严重影响患者生活质量。因此,探索DNP的发病机制和为临床治疗寻找特异性作用靶点成为亟待解决的重要问题。病理性疼痛是慢性疼痛的一种,是由于创伤、感染或代谢病引起的外周神经、脊髓和脑损伤所造成,常常表现为痛觉过敏、超敏和自发痛。糖尿病神经病理性疼痛在大约50%糖尿病患者中出现,神经病理性疼痛也是糖尿病最痛苦的并发症之一,常作为2型糖尿病的首发症状。瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV 1）是一类由热和炎症因子激活的非选择性阳离子通道,参与各种类型疼痛的发展。嘌呤能2X7（P2X7）受体属于P2X家族,与卫星神经胶质细胞参与的疼痛有关。糖尿病大鼠神经性疼痛中P2X7受体与TRPV1之间可能存在一定的联系。神经损伤发生后,背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）中的炎性细胞因子表达上调,p38丝裂原活化蛋白激酶（P38mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）磷酸化后参与痛觉过敏的发生。研究目的:本项目将探索背根神经节上的卫星胶质细胞（satellite glial cell,SGC）中P2X7受体在TRPV1介导的大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的作用及其可能机制,其研究成果将为DNP的发病机制提供实验基础和理论依据,且对DNP的临床治疗相关防治研究提供新的途径。方法:采用高糖高脂饮食喂养4周,腹腔注射低剂量链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ;35 mg/kg）破坏胰岛B细胞诱导2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠模型。除了6只由普通饲料喂养的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠为对照组（Control）外,所有建模成功的实验大鼠随机分为DNP模型组（DNP）、DNP加鞘内注射P2X7 shRNA组（P2X7 shRNA组）、DNP加鞘内注射NC shRNA组（NC shRNA组;NC shRNA为置乱序列的shRNA）,DNP加鞘内注射p38抑制剂SB203580（p38 inhibitor组;SB203580为p38 MAPK活性抑制剂）,DNP加鞘内注射含有1%的二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）的溶剂组（DMSO组,溶剂为含1%DMSO的生理盐水）,每组6只。雄性SD大鼠在鞘内注射P2X7shRNA和p38抑制剂后,记录异常机械性和热性疼痛阈值。1周后,采集所有的SD大鼠脊髓L4～L6节段的背根神经节,用于后续实验。本研究通过检测DRG中炎症因子的表达水平;检测P2X7受体和TRPV1转录水平和蛋白水平的表达情况以及免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测大鼠DRG中TRPV1与NeuN和P2X7受体与GFAP的荧光的共表达情况;检测鞘内注射后PKCε/P38MAPK/NF-κB信号通路蛋白表达,研究神经元TRPV1与卫星胶质细胞P2X7受体之间的关系。结果:1、与正常组的大鼠对比,模型组的大鼠在喂食高脂高糖饲料4周后体重明显增加（p＜0.05）;正常饮食的各组大鼠餐后血糖水平无显著差异（p＞0.05）,高糖高脂饲养四周并用STZ腹腔注射诱导大鼠成模型后,DNP组模型大鼠空腹血糖水平显著高于对照组（p＜0.01）。2、模型组在STZ注射1周后表现为显著的足底触痛觉和热痛觉过敏。与对照组相比,模型组的大鼠机械痛阈和热痛阈显著降低（p＜0.01）。3、与对照组相比,模型组的大鼠坐骨神经传导速度明显下降。NC shRNA组、DMSO组和DNP组之间无统计学差异（p＞0.05）;鞘内注射P2X7 shRNA和p38抑制剂大鼠的坐骨神经传导速度明显高于DNP组（p＜0.01）。4、行为学结果显示:NC shRNA组、DMSO组和DNP组之间无统计学差异（p＞0.05）;鞘内注射P2X7 shRNA和p38抑制剂的大鼠的机械痛和热痛敏感性明显高于DNP组（p＜0.01）。5、荧光定量PCR实验结果表明:与Control组相比,DNP组模型大鼠DRG中P2X7 mRNA水平明显升高（p＜0.01）;与DNP组相比,P2X7 shRNA组显著低于DNP组（p＜0.01）;NC shRNA组与DNP组之间无明显差异（p＞0.05）。蛋白印迹结果表明:与Control组相比,P2X7受体在DNP大鼠DRG中的水平明显升高（p＜0.01）;而与DNP组相比,P2X7 shRNA组显著降低（p＜0.01）;NC shRNA组与DNP组之间无统计学差异（p＞0.05）。6、免疫荧光结果显示:DNP大鼠DRG卫星胶质细胞P2X7受体与GFAP的共表达较Control组明显增加（p＜0.01）;与DNP组相比,P2X7 shRNA组荧光共表达水平降低（p＜0.01）;NC shRNA组与DNP组之间无统计学差异（p＞0.05）。7、荧光定量PCR实验结果表明:与Control组相比,DNP组模型大鼠DRG中TRPV1 mRNA水平明显升高（p＜0.01）;与DNP组相比,P2X7 shRNA组和p38 inhibitor组显著低于DNP组（p＜0.01）;NC shRNA组、DMSO组与DNP组之间无明显差异（p＞0.05）。蛋白印迹结果表明:与Control组相比,TRPV1受体在DNP大鼠DRG中的水平明显升高（p＜0.01）;而与DNP组相比,P2X7 shRNA组和p38 inhibitor组显著降低（p＜0.01）;NC shRNA组、DMSO组与DNP组之间无统计学差异（p＞0.05）。8、免疫荧光结果显示:DNP大鼠DRG神经元TRPV1与NeuN的共表达结果较Control组明显增加（p＜0.01）;与DNP组相比,P2X7 shRNA和p38 inhibitor组的荧光共表达水平降低（p＜0.01）;NC shRNA组、DMSO组与DNP组之间无统计学差异（p＞0.05）。9、蛋白印迹结果表明:与DNP组相比,P2X7 shRNA和p38 inhibitor组DRG中TNF-α,IL-1β,PKCε,pp38和pp65蛋白水平明显降低（p＜0.01）;NC shRNA组、DMSO组与DNP组之间无明显差异（p＞0.05）。结论:鞘内注射P2X7 shRNA和p38抑制剂可缓解糖尿病神经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏和降低TRPV1的表达,PKCε/P38 MAPK/NF-κB信号通路和炎症因子可能涉及下调P2X7R缓解TRPV1参与的糖尿病神经病理性疼痛大鼠的病理生理过程。