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目的:当归是伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根,为祖国传统医药“补血活血”之要药,被用作临床应用已有数千年的历史。多年来研究表明:多糖是其主要的药效物质之一,具有促进造血、增强免疫、抗氧化、抗肿瘤等多种作用;能有效地抑制白血病细胞的增殖,并能诱导其分化,在白血病的治疗中发挥着功补兼施的独特疗效[1-4]。但多糖结构和作用机制复杂,已成为当归及其复方药效基础研究滞后的瓶颈。近年来,有学者报道当归酸性多糖也有较强的生物活性,但酸性多糖的结构解析较中性多糖更为繁琐,尚缺乏快速、有效的方法,故其结构鲜有报道。本课题通过1)优化当归酸性多糖的提取分离工艺,2)建立同时测定多糖中中性、酸性和氨基单糖的分析方法,3)对当归酸性均一性多糖的完整一级结构进行研究,4)比较多种当归酸性均一性多糖抑制白血病细胞增殖的作用,5)探讨活性当归均一性多糖诱导细胞凋亡的机制五方面内容,层层深入,以期为解析酸性均一性多糖结构提供新方法,为阐明当归酸性均一性多糖诱导白血病细胞凋亡作用的构效关系和作用机制奠定基础,为挖掘潜在的诱导白血病细胞凋亡的中药多糖提供试验依据。方法:(1)用离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法对当归酸性总多糖进行分离纯化。用HPSEC、考马斯亮蓝法、苯酚-硫酸法、咔唑法、UV等分析方法对当归酸性多糖的均一性及分子量和蛋白质、总糖、糖醛酸含量等理化性质进行了测定。(2)采用PMP柱前衍生化法,通过HPLC色谱条件的优化,建立同时测定多糖中氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖残基的方法。(3)采用多糖全水解、甲基化分析、碳化二亚胺糖醛酸还原等化学方法和IR、HPLC、GC-MS、NMR(1H-,13C-,1H/1H-COSY,HMQC,HMBC和NOESY)等仪器方法对当归3种主要酸性均一性多糖的完整一级结构进行测定。(4)CCK-8法测定6种当归酸性均一性多糖及总糖对体外培养的白血病K562细胞增殖的影响。(5)依次用Hochest 33342荧光染色法和流式细胞术观察凋亡细胞的形态学改变、检测细胞凋亡率,用Western blot法检测Gal-3和凋亡相关调控蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达。结果:(1)经过分离纯化步骤,得到10种当归酸性多糖,分别命名为AAPS-1Ⅰ、AAPS-1Ⅱ、AAPS-1Ⅲ、AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ、AAPS-3Ⅰ、AAPS-3Ⅱ、AAPS-4Ⅰ、AAPS-4Ⅱ和AAPS-5,其中AAPS-1Ⅱ、AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ的含量较高。经检测AAPS-1Ⅰ、AAPS-1Ⅱ、AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ、AAPS-3Ⅰ和AAPS-4Ⅰ6种当归酸性多糖为均一性多糖,重均分子量依次为1.7×104、2.3×103、7.2×105、1.0×104、5.9×105和8.1×103 Da,理化性质有一定差异。(2)建立了PMP柱前衍生化HPLC法测定多糖中糖醛酸、氨基糖和中性糖的方法,优化的色谱条件为Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm i.d.×250 mm,5μm),流动相由乙酸铵水溶液(100 m M,p H=5.0)、乙腈和四氢呋喃以81﹕17﹕2的体积比组成,流速为1.0 m L/min。(3)结构研究发现:AAPS-1Ⅱ由Man、Glc N、Rha、Gal N和Glc A以8.3∶1.6∶1.0∶3.1∶2.5的摩尔比组成,单糖连接位点为T-Manp、1,6-Manp、T-Rha、1,4-Gal A和1,2-Manp,且摩尔比为1.2∶2.5∶1.4∶1.1∶1.0,进一步分析表明AAPS-1Ⅱ的结构中包含[Rha-(1→4)-Gal A-(1→2)-Manp-(1→6)-Manp-(1→]n主链和Manp-[(1→6)-Manp-(1→]n支链;AAPS-2Ⅰ由Man、Glc N、Glc A、Gal A、Glc和Gal以1.1∶4.3∶3.5∶1.1∶1.0∶1.1的摩尔比组成,主要包括T-Manp、1,4-Glcp、1,3-Gal A、T-Galp和1,2-Manp五种残基,摩尔比为1.3∶1.0∶1.3∶1.6∶1.9,进一步分析表明,AAPS-2Ⅰ的结构中包括[→3)-Gal A-(1→2)-Manp-(1→4)-Glcp-(1→2)-Manp-(1→]n、Manp-[(1→2)-Manp-(1→]n和Galp-[(1→4)-Glcp-(1→]n三个糖链;AAPS-2Ⅱ由Man、Glc N、Rha、Gal N和Gal以15.3∶5.1∶1.0∶15.3∶1.1的摩尔比组成,主要由T-Glcp、1,4-Rha、1,2-Manp和1,3,6-Manp四种残基以1.0∶1.8∶2.8∶1.3的摩尔比组成;AAPS-1Ⅰ由Man、Rha、Gal N、Glc A、Glc和Ara按照3.0∶2.5∶2.9∶2.9∶1.5∶1.0的摩尔比组成;AAPS-3Ⅰ由Man、Glc N、Gal N、Gal A、Glc和Gal按照1.0∶3.9∶1.3∶2.1∶1.4∶1.4的摩尔比组成;AAPS-4Ⅰ由Man、Glc N、Rha、Gal A和Ara按照1.2∶3.9∶2.9∶1.0∶1.1的摩尔比组成。(4)6种当归酸性均一性多糖对体外培养的K562细胞的增殖有不同程度的影响;其中AAPS-1Ⅱ、AAPS-2Ⅰ和AAPS-2Ⅱ可浓度依赖地抑制K562细胞增殖,AAPS-2Ⅰ的抑制作用最强(IC50为0.056 mg/L)。(5)AAPS-2Ⅰ与K562细胞作用72 h后出现了典型的凋亡细胞形态改变;且凋亡诱导作用会随药物浓度的增加而增大;细胞中Caspase-3和Caspase-9的前体蛋白表达水平逐渐降低,同时活化的Caspase-3和Caspase-9表达水平逐渐升高。此外,AAPS-2Ⅰ作用于K562细胞后,随着其浓度的增加,Gal-3蛋白表达明显下调,提示Gal-3可能是AAPS-2Ⅰ诱导K562细胞凋亡的上游作用靶点。结论:(1)首次建立了同时测定多糖中糖醛酸、氨基糖和中性糖组成和含量的HPLC方法,该方法准确性和精密度均良好。(2)优化了从当归中提取酸性多糖的方法,对当归酸性多糖进行了系统分离,得到10种多糖组分,其中6种为酸性均一性多糖;此6种多糖的单糖组成中都均含有氨基糖,是伞形科植物中首次发现的含有氨基糖的多糖;对其中三种含量较多的酸性均一性多糖结构进行分析,得到了两种多糖的一级结构,此结构目前未见文献报道。(3)6种酸性均一性多糖对白血病K562细胞的增殖呈现不同程度的抑制作用;其中AAPS-2Ⅰ的抑制作用最强。(4)AAPS-2Ⅰ可浓度依赖性地诱导K562细胞凋亡,其机制可能是通过Gal-3调控细胞线粒体凋亡通路产生的。