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乳腺癌细胞的耐药性是近年来乳腺癌患者化疗失败、复发率高的一个主要原因。其耐药机制有凋亡抑制、耐药相关蛋白的高表达、微小RNA的异常表达等。外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的纳米级小囊泡,富含多种RNAs、脂质及蛋白质,它可以作为信息载体,在细胞间进行物质和信息的传递。肿瘤细胞分泌的外泌体与肿瘤的生长、转移、免疫耐受以及耐药性密切相关。另外,有研究报道了多种microRNA与肿瘤的耐药性相关。例如:mi R-302,miR-369,mi R-200c,miR-34a,miR-222等。因此,本研究以乳腺癌细胞来源的外泌体为研究对象,探讨乳腺癌细胞外泌体及其相关mi RNA与肿瘤耐药性的关系,及其可能的作用机制,为肿瘤多药耐药的基因治疗提供新的思路。一、外泌体在乳腺癌细胞间传递阿霉素耐药性目的:提取乳腺癌细胞外泌体并进行鉴定,观察MCF-7/ADR细胞的外泌体能否在细胞间传递阿霉素耐药性。方法:1外泌体的提取与鉴定:采用试剂盒和超高速离心的方法提取人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺癌耐阿霉素(adriamycin,ADR)细胞MCF-7/ADR的外泌体,用透射电子显微镜观察其形态与大小,并运用Western Blot技术检测外泌体的跨膜蛋白CD9的表达水平。2外泌体对乳腺癌细胞MCF-7耐药性的影响:提取MCF-7/ADR细胞外泌体(ADR/exo),BCA法对外泌体进行定量;将ADR/exo用DiO进行染色标记,用激光共聚焦显微镜观察ADR/exo是否可以通过胞吞作用进入MCF-7细胞;用MTT法检测ADR/exo与MCF-7细胞共培养后,MCF-7细胞的增殖率,以及对阿霉素的耐药性的变化。结果:1通过试剂盒和超高速离心法都可以得到人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADR的外泌体。透射电子显微镜下,外泌体大小为30-100nm,呈现双层膜的结构。westernblot结果显示,外泌体跨膜蛋白cd9高水平表达。2激光共聚焦显微镜结果显示,mcf-7/adr细胞的外泌体(adr/exo)与敏感株细胞mcf-7共培养时,adr/exo可以进入mcf-7细胞内部。mtt结果显示,与adr/exo共培养的mcf-7细胞的增殖能力显著降低,差异具有显著性(p<0.05)。随着外泌体含量由多到少,mcf-7细胞的增殖能力依次下调16%、24%、43%、24%。mtt结果显示,mcf-7细胞与adr/exo共培养后,对阿霉素的耐药性明显提高,差异具有显著性(p<0.05)。由高浓度到低浓度,对阿霉素的耐药性依次增加5%、25%、40%、30%、29%、24%。结论:1人乳腺癌细胞mcf-7和其耐药株mcf-7/adr都可以分泌外泌体,通过试剂盒和超高速离心法都可以提取得到,得到的外泌体高表达cd9跨膜蛋白。2mcf-7/adr细胞的外泌体能够进入mcf-7细胞内部,使细胞的增殖能力降低,并通过某些机制在细胞间传递阿霉素耐药性,使受体细胞对阿霉素的耐药性明显提高。二、乳腺癌细胞外泌体及其相关mirna与肿瘤耐药性的关系目的:分析乳腺癌细胞及其外泌体中耐药相关microrna的表达差异,选取目标microrna分子,用软件预测其可能的靶分子,通过microrna分子类似物和抑制剂研究目标分子及其靶分子的表达变化,探讨乳腺癌细胞外泌体及其相关mirna与阿霉素耐药性的关系,及其可能的作用机制。方法:1耐药相关的microrna分子的筛选:利用给totalrna加尾的方法,运用qrt-pcr技术在microrna的水平对mcf-7细胞、mcf-7/adr细胞、mcf-7细胞外泌体(mcf-7/exo)、mcf-7/adr细胞外泌体(adr/exo)的多个耐药相关的microrna的表达进行定量分析,筛选出表达差异大的目标microrna分子进行后续实验。2目标microrna分子在乳腺癌细胞内可能的靶分子的筛选:利用生物信息学软件,预测与乳腺癌耐药性相关的,与目标microrna分子的3’utr区有部分结合的靶基因。运用qrt-pcr技术在mrna的水平对mcf-7细胞、mcf-7/adr细胞、mcf-7/exo、adr/exo中的多个靶基因的表达进行定量分析,筛选出可能的靶基因进行后续实验。3目标microrna分子与细胞内靶分子的作用关系:合成目标microrna分子类似物及其抑制剂,并将其转染入mcf-7细胞、mcf-7/adr细胞。qrt-pcr检测转染细胞及其外泌体中目标microrna分子及其靶蛋白的mrna表达变化。westernblot检测转染后细胞内靶蛋白的表达变化。4目标microrna分子对乳腺癌细胞耐药性的影响:将目标microrna分子类似物或抑制剂转染入mcf-7/adr细胞,mtt法检测细胞对阿霉素的敏感性的变化。结果:1qrt-pcr结果显示,与mcf-7细胞和mcf-7/exo相比,mcf-7/adr细胞和adr/exo中的mir-222-5p,mir-17-5p,mir-34a-5p,mir-let-7a,表达均具有显著性差异(p<0.05),细胞内mir-21-5p,mir-125b-5p和外泌体内mir-342-3p没有显著性差异。其中,mir-34a-5p在mcf-7/adr细胞中表达显著降低,而在adr/exo中表达显著升高。2通过软件预测,得到4个与乳腺癌耐药性相关的,可与mir-34a-5p结合的靶基因:notch1、hdac1、mtor、hdac7。qrt-pcr结果显示,与mcf-7细胞和mcf-7/exo相比,mcf-7/adr细胞和adr/exo中靶基因在mrna水平上均有显著性差异(p<0.05)。notch1、hdac1、mtor、hdac7,在细胞中的表达为1.85±0.012,1.23±0.031,2.37±0.064,2.07±0.082;在外泌体中的表达为0.14±0.007,0.07±0.019,mtor、hdac7在外泌体中未表达。3qrt-pcr结果显示,将mir-34a-5pmimic转染mcf-7/adr细胞后,mcf-7/adr细胞及其外泌体中mir-34a-5p和notch1的表达水平,与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。mi-34a-5p在mcf-7/adr细胞和其外泌体中的表达分别为54.1±0.031,1.23±0.063;notch1的表达分别为0.51±0.017,4.72±0.089。westernblot结果显示,将mir-34a-5pmimic转染mcf-7/adr细胞后,靶蛋白notch1的表达明显下调,具有显著性差异(p<0.05)。4mtt结果显示,与阴性对照组相比,mcf-7/adr细胞转染mi R-34a-5p mimic后,对阿霉素的耐药性下调,具有显著性差异(P<0.05)。结论:1 miR-34a-5p参与调节乳腺癌细胞MCF-7对阿霉素的耐药过程,而NOTCH1基因可能是其调控的靶基因之一。2转染mi R-34a-5p mimic能够有效上调miR-34a-5p在乳腺癌细胞MCF-7/ADR中的表达,同时引起NOTCH1蛋白在细胞的表达显著下降,并且能够提高细胞对阿霉素的敏感性。3与MCF-7细胞相比,miR-34a-5p在MCF-7/ADR细胞中表达显著降低,而在ADR/exo中表达显著升高,提示细胞耐药性的产生,部分原因可能是因为耐药细胞中mi R-34a-5p可以被外泌体包裹并排出细胞外,从而导致细胞内的有效浓度降低所致。