L-型钙通道通过控制钙离子进入细胞，从而引起膜电位的改变，并且在心肌细胞动作电位的产生、兴奋收缩耦联、激素和神经递质的释放以及功能依赖性的基因转录中起着重要作用。Ca2+在细胞内信号通路中不仅是一种有效的激动剂，当它超载时也是一种致毒剂。作为细胞内Ca2+内流的最主要的途径，L-型钙通道受两种Ca2+依赖性的反馈机制调节，即Ca2+依赖性易化(Ca2+-dependent facilitation,CDF)和Ca2+依赖性失活(Ca2+-dependent inactivation, CDI)。CDF是指细胞内基础Ca2+浓度升高或者反复短暂去极化导致钙通道开放增强的过程;CDI是指在持续去极化状态下内流的Ca2+促进钙通道关闭的过程。　　 Calmodulin（CaM，钙调蛋白）是一种广泛存在于生物体的钙结合蛋白，它是细胞内Ca2+的重要受体，通过与Ca2+结合从而直接或间接调节多种重要生理功能，例如调节各种酶的活性，肌肉收缩和舒张，神经系统功能以及基因表达等。CaM蛋白分子量为17.6kD，由148个氨基酸组成，空间结构呈亚玲状，两端膨大呈球形，中间由细长的α-螺旋结构连接，两端(N-lobe，C-lobe)各有两个Ca2+结合位点，其中C-lobe与Ca2+的亲和力是N-lobe的10倍。研究者普遍认为CDF和CDI都需要Ca2+/CaM结合到L-型钙通道的α1亚型上。研究表明CaM与Cav1.2以一定的形式结合，并且CaM与Cav1.2的C末端结合对通道CDF和CDI的调节起着重要作用。Cav1.2的C末端与CaM的结合位点包括IQ基序、位于IQ基序和EF-hand序列之间的A、C或preIQ序列。　　 Zühlke和Reuter等人报道称将IQ序列敲除，L-型钙通道的CDI也随之消失。随后研究也支持此观点，认为Cav1.2的C末端与CaM结合在介导CDI的过程中起着重要作用。另外Pitt、Pate、Romanin和Erickson等人均报道指出在EF-hand序列和IQ序列之间的C、CB、preIQ序列可以和CaM结合从而调节Cav1.2的CDI。另有报道表明IQ、preIQ分别可以与一个CaM分子结合从而调节Cav1.2的CDF和CDI。因此，关于preIQ、IQ与CaM相互作用后对L-型钙通道的调节作用有待进一步研究。　　 Cav1.2除了C末端有CaM结合位点外，报道证实其Ⅰ-Ⅱ loop和N末端也都有CaM结合位点，其中，N末端的CaM结合位点被称为NSCaTE(N-terminalSpatial Ca2+ Transforming element)。尽管如此，也有研究表明CaM不能和Cav1.2的N末端结合。因此，有关CaM与Cav1.2的N末端结合情况有待进一步研究。CaM两端(N-lobe，C-lobe)各有两个Ca2+结合位点，其中C-lobe与Ca2+的亲和力是N-lobe的10倍。一些研究表明CaM的C-lobe和N-lobe可以单独调节通道的CDF和CDI，但也有研究指出调节通道的CDF和CDI需要CaM的C-lobe和N-lobe同时存在。因此，关于CaM的lobe特异性地调节CDF和CDI的机制有待进一步阐明。另外，在调节CDF和CDI的过程中，到底有多少个CaM分子与Cav1.2结合？Mori等人报道表明一个CaM分子是必须并且足够的引发与之相结合的通道的CDI;最近晶体学研究证明Cav1.2的preIQ-IQ基序可以结合多个CaM分子。因此，尽管Cav1.2上的多个CaM结合位点已经被证实，但是在Ca2+依赖性的调节过程中CaM如何与钙通道结合，这一问题仍说法不一，有待进一步研究。　　 本实验采用半定量的GST pull-down实验方法，研究在不同的CaM（或突变体）浓度和Ca2+浓度条件下，CaM（或突变体）与Cav1.2的C末端不同蛋白片段和N末端相结合的情况。　　 实验材料和方法:　　 1、材料　　 健康成年雌性豚鼠，体重250-350 g，由中国医科大学实验动物中心提供。pGEX-6p-3/CaM、 pGEX-6p-3/CaM12(E31A+E67A)、 pGEX-6p-3/CaM34(S101F+E140A)、pGEX-6p-3/CaM1234(E31A+E67A+S101F+E140A)质粒均由日本鹿儿岛大学Kameyama教授惠赠，pGEX-6p-3/CT1、pGEX-6p-3/CT2、pGEX-6p-3/CT3、 pGEX-6p-3/NT、 pGEX-6p-3/preIQ、 pGEX-6p-3/IQ和pGEX-6p-3/preIQ-IQ由生工生物工程（上海）有限公司制作，异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)、溶菌酶、氨苄青霉素(AMP)均购自Sigma公司，PreScission Protease与Glutathione-Sepharose4B beads(GS-4B beads)购自GE Healthcare公司，其他试剂均购自BIOSHARP公司。　　 2、方法　　 (1)质粒转化及鉴定:将相对应的质粒转化进入Escherichia coli BL21感受态细胞中。经0.1 g/LAMP琼脂培养板37℃过夜筛选后，调取单克隆菌种接种于装有LB培养液的试管中，采用碱裂解法提取质粒，质粒经ECoRⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒。　　 (2)纯化CaM、CaM12、CaM34和CaM1234:将相对应的质粒转化进入BL21中，在BL21中将相对应的蛋白片段表达出GST融合蛋白;采用超声法破碎大肠杆菌，释放蛋白;采用Glutathione-Sepharose4B beads(GS-4B)纯化融合蛋白;利用PreScission Protease去除融合蛋白上的GST，获得CaM、CaM12、CaM34和CaM1234蛋白。纯化后蛋白采用常规15％ SDS-PAGE电泳检测其纯度及相对分子量，采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定其浓度，采用膜片钳方法验证其活性。　　 (3)纯化CT1、CT2、CT3、NT、preIQ、IQ和preIQ-IQ等膜蛋白:将相对应的质粒转化进入BL21中，在BL21中将相对应的蛋白片段表达出GST融合蛋白;因膜蛋白难溶于水的特点，因此加入1.5％ N-lauroylsarcosine sodium salt在4℃静置30 min，增加其溶解性;采用超声法破碎大肠杆菌，释放蛋白，采用Glutathione-Sepharose4B beads(GS-4B)纯化融合蛋白。纯化后蛋白采用常规15％SDS-PAGE电泳检测其纯度及相对分子量，采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定其浓度，调整其浓度约为0.04 g/L。　　 (4)蛋白与蛋白结合实验:将分离纯化的Cav1.2不同蛋白(CT1、CT2、CT3、NT、preIQ、IQ和preIQ-IQ)与不同浓度的CaM及突变体(0.1，0.35，0.7，1.4，2.1，3.5，10，50μM)在含不同[Ca2+](≈free，100 nM，10μM和2mM)的TrisBuffer里，4℃反应4h，游离[Ca2+]采用WEBMAXC v2.10软件计算。结合于beads上的CaM或突变体和α1c蛋白片段重悬于5×SDS上样缓冲液中，并采用15％ SDS-PAGE电泳分离并检测不同蛋白及蛋白量。SDS-PAGE胶上的蛋白带通过考马斯亮蓝染色显示，并采用Photoshop软件进行定量分析。　　 (5)数据分析:总量[CaM]-结合[CaM]的关系曲线用SigmaPlot10.0软件中的Hill公式进行拟合，其中一点模型的拟合公式如下:Y=Bmax·X/Kd+X　　 其中Bmax为最大结合量，X为游离配体浓度，Kd为表观分离常数。本实验中的游离CaM浓度接近于CaM总浓度，所以X即为CaM总浓度。　　 二点模型的拟合为两个一点模型拟合的总和，其公式如下:Y=Bmax1·X/Kd1+X+Bmax2·X/Kd2+X　　 其中Bmax1、Kd1、Bmax2、Kd2为高亲和力结合位点和低亲和力结合位点相对应的Bmax和Kd。　　 各组实验结果以平均值±标准误表示，两组之间比较采用Student，st检验，P＜0.05为差异有显著性意义。　　 结果:　　 1、SDS-PAGE显示纯化的CaM及突变体蛋白、Cav1.2不同蛋白具有较高的纯度;蛋白浓度结果表明BL21表达了大量的CaM及突变体蛋白、Cav1.2不同蛋白;纯化后CaM及突变体蛋白可恢复已run-down心肌细胞膜钙通道的活性。　　 2、采用GST pull-down实验方法证明，纯化的Cav1.2 C末端的三个融合蛋白片段，只有GST-CT1可与CaM稳定结合;作为对照，CaM几乎不与空白GS-4B或GST结合，表明CaM可特异性地与Cav1.2结合。　　 3、preIQ和IQ均可以结合一个CaM或CaM12，并且具有浓度依赖性及[Ca2+]浓度依赖性。同时，应用软件对得到的数据进行分析，发现IQ与CaM结合的亲和力更高:KdIQ0.58μM＜ KdpreIQ0.75μM。　　 4、CT1（含EF-hand，preIQ和IQ）可以结合二个分子的CaM或CaM12,同时preIQ-IQ（涵盖preIQ和IQ序列）也可以同时结合二个CaM或CaM12分子，这些结合均具有浓度依赖性及[Ca2+]依赖性。　　 5、CaM、CaM12与CT1、preIQ、IQ、preIQ-IQ的结合均具有浓度依赖性及[Ca2+]依赖性，但是CaM34、CaM1234与CT1、preIQ、 preIQ-IQ的结合只具有浓度依赖性，而没有[Ca2+]依赖性，说明CaM的C-lobe在调节CaM与Cav1.2的[Ca2+]依赖性结合中起重要作用。　　 6、在10μM和2 mM[Ca2+]时，CaM和CaM34可以较明显的与NT结合。这结果提示只有在较高的[Ca2+]（＞10μM），CaM才能与Cav1.2的NT结合。　　 7、不管在高[Ca2+]还是在低[Ca2+]，CaM34和CaM1234只与preIQ结合，不与IQ结合。在低[Ca2+]，CaM及三种突变体与preIQ结合的Kd值均小于其与IQ结合的Kd值，证明在低[Ca2+]，CaM可选择性地与preIQ结合。　　 结论:　　 1、成功纯化获得高纯度高浓度并具有生物活性CaM及相关突变体蛋白。　　 2、采用GST pull-down实验方法证明CaM可特异性地与Cav1.2结合。　　 3、preIQ和IQ均可以结合一个CaM，IQ与CaM结合的亲和力更高。　　 4、Cav1.2的C末端可结合二个分子的CaM。　　 5、在感受[Ca2+]动态变化过程中，CaM的C-lobe起着更为重要的作用。　　 6、CaM要与Cav1.2的N末端结合，需要较高[Ca2+]。　　 7、在低[Ca2+]，CaM可选择性地与preIQ结合。　　 我们的实验数据为研究CaM和Cav1.2的结合及L-型钙通道的调节机制提供了新的、基本的信息。