论文部分内容阅读
糖尿病是目前重要的社会公共卫生问题,糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症,是影响糖尿病死亡率的重要因素。在导致糖尿病肾病发生的诸多因素中,氧化应激增强是影响2型糖尿病及糖尿病肾病发生发展的主要因素。RNA氧化是氧化应激增强所致核酸损伤的重要一环,是最近发现的新的致病机制。研究表明,RNA氧化标志物8-oxo-Gsn是糖尿病死亡的独立预测指标,因此,探索RNA氧化损伤与糖尿病及其并发症发生发展的关系对揭示糖尿病及其并发症发生机理、对糖尿病并发症的防治具有重要意义。氧化还原反应紊乱所致的胰岛素分泌过剩最近被认为是诱发2型糖尿病的始动因素,具体原因和机制尚不清楚。虽然先天性高胰岛素血症及新生儿永久性糖尿病起病于胰岛素基因突变造成的胰岛素原变异,但是2型糖尿病罕见胰岛素基因突变。研究发现,RNA与DNA序列之间存在广泛的差异,而本课题组的前期研究发现RNA氧化损伤可导致异常蛋白质的产生。因此,本研究拟进一步探索RNA氧化损伤与胰岛素原变异的相关性,为揭示2型糖尿病的发生机理提供科学的实验依据。主要研究方法及结果:1.以链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠为模型,运用ID-LC-MS/MS法评估糖尿病大鼠核酸氧化情况并进行各脏器间DNA和RNA氧化程度的比对。研究发现高糖状态下多种器官8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn含量增加,不同脏器8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn含量增加程度不同,肾脏核酸氧化损伤更加显著。8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn含量随着高血糖的持续而增加,8-oxo-Gsn含量增加更为明显和广泛,这一现象在不同器官、血浆和尿液中表现一致。血浆和尿液8-oxo-Gsn浓度明显高于8-oxo-dGsn水平,且尿液中8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn的水平显著高于血浆。2.以4-16周龄具有BKS背景的雄性db/db小鼠为模型,评估尿和肾组织中核酸损伤标志物的相关关系,并探索这些标志物与肾损伤的关系。研究发现db/db鼠肾脏8-oxo-Gsn比8-oxo-dGsn出现更早且升高幅度更大。尿中8-oxo-Gsn 和 8-oxo-dGsn 的波动与其在肾组织中的变化有 良好的一致性,尿中 8-oxo-Gsn同样高于8-oxo-dGsn。尿中8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn随肾脏病理损伤的加重而增加,与尿微量白蛋白的变化关系密切。3.根据人胰岛素原的氨基酸序列,利用Expasy数据库设计肽段标准品并合成,建立电喷雾液相色谱质谱的胰岛素原变异多肽绝对定量检测方法。获取了变异胰岛素原多肽绝对定量检测方法的基本参数,用EndoproteinaseGluC酶切胰岛素原标准蛋白验证了其可行性,方法的敏感度为5～10fmol/μl。4.用定点诱变的方法建立人野生型和变异型胰岛素原慢病毒表达载体,包装病毒后浸染AtT-20/D16v-F2细胞构建稳定细胞株。初步获取了表达胰岛素原及胰岛素原变异蛋白的细胞株。结论1.高糖引起的氧化应激增强可以造成糖尿病大鼠多器官核酸氧化损伤增加;不同器官对核酸氧化损伤的易感性不同,肾脏核酸氧化损伤更加显著。2.核酸氧化损伤随着高血糖的持续而增加,RNA氧化损伤出现更早且升高更为显著。3.高糖状态下肾脏RNA氧化损伤显著,RNA氧化损伤是db/db小鼠糖尿病肾病的早期现象,与db/db小鼠糖尿病肾病其他病理变化关系密切。4.尿液8-oxo-Gsn可以作为评估糖尿病及糖尿病肾病氧化应激状态的良好指标。5.初步建立了人胰岛素原变异蛋白检测方法和表达人胰岛素原或其变异体的细胞株,为后期研究提供了基础。