农杆菌及基因枪介导的茶树外源基因导入体系优化研究

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茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)作为我国一种重要的经济作物,其优良品种的培育和推广,是科技在茶叶生产中发挥效益的重要体现。仅仅依靠传统的育种方法已不能满足现代社会需求的迅猛发展。因而必须吸收和借鉴现代科学技术成果,利用这些新的方法和手段,培育出更优秀的茶树品种。植物转基因技术作为植物基因工程的一个重要组成部分,不仅为基因表达调控和遗传研究提供了一个理想的实验体系,更为植物(尤其是农作物)的定向改良和分子育种提供了一个有效的途径和方法。 本研究在前人的基础上,优化了茶树的遗传转化系统。主要内容如下: 进一步调整了茶树常用的遗传转化体系—农杆菌体系。在用农杆菌浸染前,将茶树外植体预培养在含有PVP(16g/L)的预培养基上2-3d可提高转化频率。但在预培养基中添加CaCl2反而使转化频率降低。 对基因枪介导的茶树转化体系的有关参数进行优化。比较了不同的预培养条件,结果表明:AgNO3对转化频率影响不大;此外,茶树外植体若在含有AgNO3的培养基上培养时间超过30d,会发生褐化。当AgNO3和CaCl2与PVP一起用于预培养时,得到的转化率最高。即使在没有AgNO3和CaCl2的条件下,在愈伤诱导培养基(1/2MS+2,4-D+KT)中添加PVP作为预培养培养基,也能得到较好的转化效果。渗透处理不仅不能提高GUS的表达率,反而使愈伤再生困难。优化后的基因枪转化制弹程序为:60mg/ml钨粉悬浮液10μl中加入1.6μl质粒DNA(1μg/μl),再分别加入0.1M的亚精胺4μl,2.5M的CaCl2 15μl,最后定容至48μl;每次轰击上样量为8-10μl。在轰击压力7MPa,射程5cm,真空度-0.095MPa的条件下轰击一次,不论对GUS表达还是愈伤的再生都是较为适合的轰击条件。基因枪转化后抗性筛选2个月,抗性愈伤组织存活率为5.0%~12.1%。 比较了农杆菌法(AGR),基因枪法(BOM)及农杆菌与基因枪结合(BTA,BPA和BOA)等方法对茶树遗传转化效率的影响。瞬间表达的结果及抗性愈伤筛选的结果都显示,农杆菌与基因枪结合使用比两种方法单独使用更有助于提高茶树转化的效率。 本实验中三个茶树品种一乌牛早、劲峰和紫笋得到的转化频率相似。根据本实验的结果,品种对转化的影响,不存在于品种间细胞感受能力的差异;然而,可能不同品种间再生能力的强弱是实验成败的另一个关键。
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