Streptomyces tremellae产生活性物质的分离鉴定及基因的分析

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本文对Streptomyces tremellae(链霉菌Js-1T)代谢产物进行了研究,对抗有害疣孢霉菌的成分进行了分离纯化以及其结构鉴定,并且进一步测定了其抗肿瘤HepG2细胞的活性,最后对链霉菌Js-1T全基因组基因以及H2Phe代谢通路进行了预测。对链霉菌代谢产物的分离过程中,以有害疣孢霉菌作为指示菌,发酵液经过浓缩,乙醇去蛋白,正丁醇萃取,200-300目的硅胶分离,高效液相色谱(HPLC)分离最终得到纯化的活性物质。该过程的分离步骤优化结果为,确定了正丁醇萃取的溶液pH应该在6-7之间;硅胶过柱中的流动相确定为氯仿:甲醇:冰乙酸=4:1:0.5;甲醇浓度为20%时,HPLC检测活性物质出峰时间为8.521min,主要杂质峰为6.218min,可用于活性物质检测,甲醇浓度为15%时,出峰时间为10.259min,主要杂质峰为7.304min,用于活性物质的分离效果更好。纯化的活性物质通过结构鉴定,鉴定活性物质的分子式为C9H13NO2,最终经HPLC、ESI-MS、NMR进行结构分析确定该物质为苯丙氨酸(Phe)的拮抗剂H2Phe。干扰的杂质峰就是Phe。H2Phe浓度与HPLC检测峰面积的对应关系为y=4000000x+86119,呈正相关的关系,R2=0.9973。可知Phe浓度与HPLC检测峰面积的对应关系为y=23758x+1402.8,呈正相关的关系,R2=0.99973。H2Phe抗有害疣孢霉菌、兔致病真菌以及肿瘤HepG2细胞的结果发现,H2Phe的浓度与抑制有害疣孢霉菌的相关方程式为:y=0.18284x+0.00613,可知两者之间呈现正相关性,R2=0.99925,因此H2Phe对有害疣孢霉菌的最小杀菌浓度为5.44mg/ml,其中LC50=2.70mg/ml。H2Phe对于兔未知病原菌几乎没有抑制作用。H2Phe浓度为450μg/ml时,经过24h培养,对细胞HepG2的抑制率就达到40%以上,培养到第96h的时候,H2Phe的浓度达到50μg/ml以上,对HepG2细胞表现出很高的抑制率,抑制率为82.5%以上,此时所有浓度的抑制效果都相差不多。另外,实验结果中50-350μg/ml系列浓度与HepG2细胞的抑制率并没有表现出正相关的关系。细胞HepG2的克隆形成实验中,H2Phe作用HepG2细胞7天后,药物浓度为12.5μg/ml的时候,抑制效果还不是很好,但是提升到25μg/ml的时候,效果就开始明显的表现出来,抑制率几乎达到100%。链霉菌Js-1T经过全基因组测序、拼接以及预测,拼接碱基数为11.21Mb,测序的覆盖度达到219倍,拼接结果总共产生的Contigs数为7701,平均长度为1526,其中Contig的N50=7555;拼接的Scaffolds总共才121个,Scaffold的平均长度为96290,Scaffold的N50=229970,N90=49859。总共预测的基因数目为11074个,总的基因长度为10198965bp,占总基因组数目的百分比为86.76%,其中基因的平均碱基数为920bp,CDS的数目为10953个,重复区域为7个,总的RNA数为121个。H2Phe的代谢基因预测,确定PROKKA00053对应的蛋白具有PDXs活性,并且H2Phe代谢相关基因就在PROKKA00053蛋白对应的基因左右。
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