在许多病理及生理过程中，血管生成是至关重要的。恶性肿瘤具有非常典型的持续性、失控性的毛细血管生长现象。实体肿瘤的发生、发展依赖于肿瘤细胞或宿主细胞不断释放致血管生成因子诱导新生血管的形成，通过新生毛细血管为肿瘤提供必要的营养，带走肿瘤代谢产物，为肿瘤发展、转移提供必要的条件。实验证明，针对不同致血管生成因子的拮抗剂可有效抑制SCID小鼠身上移植瘤的生长及转移，因此抗血管生成逐渐发展为肿瘤治疗中新兴的治疗途径。 目前，已经发现多种信号分子在肿瘤血管的发育中起着重要的调节作用，例如bFGF、VEGF、ANG等等，其中，血管生成素(angiogenin ANG)是第一个从肿瘤细胞培养基上清液中分离得到的具有强力致血管生成效应的活性蛋白质。它与人胰RNase有35％氨基酸序列一致，是一种肝素结合蛋白，可以诱导血管生成过程中绝大部分独立事件的发生，包括与内皮细胞结合、刺激第二信使、调节细胞粘附、激活细胞相关蛋白、诱导细胞侵袭、参与内皮细胞的管型塑型过程等等。随后的研究表明，不同来源的肿瘤组织及肿瘤细胞系中均有ANG mRNA的表达，在肿瘤发生的不同阶段刺激新生血管的形成；肿瘤患者血液中ANG水平高低与肿瘤的恶性程度密切相关。因此，ANG是研究抗血管生成的一个很好的靶分子。如果能够抑制ANG诱导的肿瘤血管形成，就有可能达到抑制肿瘤生长、甚至杀伤肿瘤细胞的目的。 以往的实验证明，ANG拮抗剂，例如特异性单抗mAb 26-2F、ANG的肽拮抗剂ANI-E、磷脂酶C抑制剂如新生霉素以及可溶性的结合蛋白—肌动蛋白等等，都可以阻碍人类肿瘤在无胸腺小鼠体内的生长，组织学分析显示这些拮抗剂可以减少或清除肿瘤组织中的新生血管。但是传统的ANG桔抗剂的作用点几乎均是己经生成的ANG蛋白，针对ANG发挥作用的不同环节而设计，效率低、易受干扰、还可能引起一些非特异性作用。近来兴起的反义核酸技术为抗血管生成提供了新的策略并展示了广阔的前景。其基本原理是通过碱基配对原则，反义核酸特异性的与某些DNA或RNA结合，阻止其复制、转录和翻译，从而达到封闭基因和抑制表达的作用。所以我们将反义技术应用于ANG桔抗剂的研究中，ANG反义核酸的作用点在蛋白以上水平，可以把ANG消灭在“萌芽”状态，具有高效率和高特异性。本课题包含体外与体内实验两部分，在细胞水平与整体动物水平对ANG反义核酸进行研究验证。主要目的是研究ANG反义核酸的抗血管生成效应与抗肿瘤效应，探讨其作为抗肿瘤血管生成药物的可行性。方法：1．脂质体介导人ANG反义核酸转染A549细胞及其效应检测 本课题采用人肺癌A549细胞株进行体外培养。人工合成与人ANG的mRNA含AUG起始密码区域互补的反义核酸，并对其进行整链的硫代磷酸化修饰年用脂质体Lipofectin介导人ANG反义核酸来转染A549细胞。为提高转染效率，我们采用形态观察、细胞计数及D血＊uSA等方法对转染时限、脂质体用量等指标进行了优化筛选。并用免疫组化法检测细胞内ANG蛋白的表达情况，ELISA方法检测培养基中ANG蛋白浓度，对反义核酸的体外效应进行定量与定性分析。二．人ANG反义核酸抑制SCID小鼠体内肿瘤生长的效应研究 在体外实验基础上，将体外用ANG反义核酸转染过的A549细胞异种移植于SCID小鼠的肩背部皮下，然后按照一定的时间间隔，用反义核酸进行肿瘤内注射治疗，同时设立空白对照组。治疗两个月后，摘眼球采取小鼠血液，ELISA法检测小鼠血浆中ANG蛋白浓度；杀鼠取瘤，测量肿瘤体积，按照公式抑瘤率（％）叶卜（治疗组开始平均瘤体积一治疗组结束平均瘤体积）／（对照组开始平均瘤体积一对照组结束平均瘤体积）］XI 00来计算ANG反义核酸的抑瘤率；肿瘤标本石蜡包埋切片、常规HE染色， Vll！ 观察肿瘤细胞的形态学改变，并进行肿瘤组织的ANG免疫组化染色，显 示肿瘤细胞中ANG表达情况。 结果： （一）脂质体介导人ANG反义核酸转染A549细胞及其效应检测 1＊ 转染时限的确定 实验分别对转染时限为 6、8、10、12、14小时的 A549细胞进行光镜 观察，发现转染时限8叶 小时的细胞形态变圆、聚集，贴壁率无明显改 变；转染时限超过10小时后，细胞有崩解现象，贴壁率明显降低。表明 8J 小时为最佳转染时限，既保证了转染所需要的时间，又不会对细胞活 力造成严重影响。 1．2 脂质体用量选择 实验以Dot．ELISA法检测不同脂质体用量（2．5、5刀、7．5、10ml几） 的转染结果，显示 ANG浓度为 0．34umol／L、细胞数为 2刀X 10’个左右时， 脂质体的最佳用量为sml几，此用量下的转染可以最大限度的抑制ANG蛋 白的分泌。 1．3 细胞ANG免疫组化 部分转染反义核酸的A549细胞胞质几乎不着色，核染成淡蓝色；而 对照组A549细胞胞质染成明显的棕黄色，表明在转染ANG反义核酸后