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目的:观察不同浓度17β-雌二醇对大鼠BMSCs成骨分化的影响,并分析成骨分化过程中经典Wnt信号通路相关信号转导分子的表达差异,探索17β-雌二醇通过Wnt/β-catenin信号通路调节大鼠BMSCs成骨分化的作用机制,为临床应用雌激素或SERMs治疗PMOP提供理论依据。方法:应用全骨髓培养法分离4周龄雄性SD大鼠双下肢的骨髓单个核细胞,通过多次换液及传代时控制胰酶消化时间纯化BMSCs;利用BMSCs的三个特性对其进行鉴定,(1)贴壁特性;(2)多向分化潜能:对P2代细胞分别进行成骨、成脂诱导并设空白对照,每3天全量换液,于成骨诱导第7天进行ALP染色,成骨诱导第21天进行Alizarin Red S染色,成脂诱导14天进行Oil Red O染色,观察其分化能力;(3)利用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测:CD34、CD44、CD45、CD105。将鉴定成功的大鼠BMSCs接种于多个6孔板中,进行分组培养,分别为0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L组,待每孔细胞达到约80%融合,以相应梯度浓度17β-雌二醇处理各组细胞,DMSO处理作为对照组,同时对各组进行成骨诱导,每3天全量换液,于成骨诱导第7天进行ALP染色并进行ALP定量分析,成骨诱导第7天分别提取各组细胞总蛋白,利用Western blot检测各组细胞Wnt10b、β-catenin、LRP5表达量,成骨诱导第21天进行Alizarin Red S染色。结果:利用全骨髓培养法分离出的大鼠骨髓中的单个核细胞形态良好,增殖能力强;通过多次换液及传代时控制胰酶消化时间可纯化BMSCs,P2代细胞纯度可达95%;对P2代细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,经鉴定BMSCs可向成骨细胞及脂肪细胞分化;利用流式细胞术鉴定P2代细胞,证实所得细胞为间充质来源且均一性较高;对P2代细胞进行成骨诱导的同时用梯度浓度(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)的17β-雌二醇进行处理,成骨诱导7天后ALP染色及定量分析显示,随着17β-雌二醇浓度的增加,ALP表达量逐渐增加,且活性增强,其中10-5 mol/L组活性最强,各处理组与空白对照组比较差异均具有统计学意义;成骨诱导第7天,对各组目标蛋白表达量进行Western blot检测显示:Wnt10b、β-catenin表达量随着17β-雌二醇浓度的增加而逐渐增加,10-5mol/L组最高,LRP5各组表达量无明显差异;成骨诱导第21天Alizarin Red S染色结果显示:各组红褐色矿化结节的数量亦随着17β-雌二醇浓度的增高而逐渐增加。结论:通过全骨髓培养法可分离筛选出纯度高、均一性好、增殖能力强的BMSCs;BMSCs在特定的诱导条件下可向成骨细胞及脂肪细胞分化,具有多向分化潜能;体外成骨诱导培养条件下,雌激素可浓度依赖性的促进大鼠BMSCs成骨分化,参与成骨细胞的分化成熟,并且此效应可能是通过上调经典Wnt信号通路中Wnt10b及β-catenin的表达实现的,而雌激素对经典Wnt信号通路中膜受体LRP5的表达无明显影响。