目的:脑卒中(Stroke)作为一种发病突然、病因复杂的神经系统疾病,具有高发病率、高致死率、高致残率等特点,其中脑卒中神经病变(stroke neuropathy,SN)的治疗康复属临床医学难题。目前,临床治疗脑卒中药物的有效性较差,且早期溶栓治疗的时间窗的把握比较困难,因此康复治疗SN显得尤为重要。神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)作为一类未分化前体细胞,在成年哺乳动物神经系统中仍保留自我增殖分化的生物学特性,能够分化为神经元和胶质细胞。因此利用NSCs填补神经元缺失成为抗SN治疗的新策略。由于其良好的治疗前景,研究利用药物调控内源性NSCs的增殖分化,从而达到治疗SN的目的具有意义重大。目前,国内外研究多围绕信号通路、细胞因子对NSCs的调控等方面展开,但对民族药物调控NSCs增殖治疗SN的药理学机制研究较少。前期研究表明蒙药“白脉散”及其有效成分组具有抗氧化、抑制神经元凋亡和抗SN的作用,但对于NSCs的调控及机制研究仍是空白。本实验以“有效成分组学”理论为指导,建立体内外NSCs缺氧损伤模型,从促进NSCs增殖的角度验证BMECG的神经保护功能,并对其分子机制进行初步探索研究,探讨BMECG作为民族药大复方治疗SN的应用潜力,为民族药物的的研究和开发提供新思路。方法:1.采用悬浮培养法,培养大鼠大脑皮层NSCs。对所培养的NSCs进行增殖率以及针对NSCs标志性蛋白Nestin的免疫荧光检测;针对神经元标志性蛋白MAP-2,对获得的NSCs进行体外诱导分化能力的免疫荧光鉴定;在显微镜下,对培养及分化的NSCs进行形态学观察。建立原代NSCs缺糖缺氧复供(OGD/R)损伤模型,将纯化的NSCs分为正常组、模型组、阳性药组、BMECG高、中、低剂量组6组。缺糖缺氧建模后,利用流式细胞仪,采用免疫荧光标记法检测CFDA-SE标记的大鼠NSCs。通过观察给药后NSCs第1、3、7天各子代荧光强度的变化情况,来研究不同浓度BMECG对NSCs的抗损伤、促增殖能力。2.利用基因芯片技术分析BMECG调控OGD/R损伤后NSCs的基因表达变化。采用全转录组表达谱芯片对模型组与BMECG干预组NSCs给药第7天差异基因变化情况进行研究,并利用差异基因数据进行Pathway等分析,筛选出BMECG发挥促NSCs增殖作用的靶基因和相关信号通路,为进一步研究其促NSCs增殖的分子机制提供实验依据。3.采用双侧颈总动脉夹闭法建立昆明小鼠全脑缺血再灌注模型(BCAO),研究BMECG对模型小鼠的干预情况。利用HE染色观察脑组织形态学变化和损伤状况;使用平衡转棒仪对模型以及小鼠脑卒中神经病变后药物干预的行为学进行评价;通过免疫组化染色法测定脑缺血损伤区Nestin蛋白表达变化,判断NSCs增殖率;并采用RT-PCR技术测定小鼠大脑皮层Notch1、Musashi1、Numb等关键节点mRNA的改变,研究BMECG对NSCs促增殖Notch通路的表达来探索其促NSCs增殖作用的机制。结果:1.体外实验中,BMECG对NSCs具有明显地抗缺糖缺氧损伤、促增殖作用,并筛选出活性高于阳性药Rg1的有效剂量(p<0.05)。在不同给药时间点进行观察,第3天,BMECG浓度为12.5 μg/L(中剂量组)时,CFSE标记NSCs荧光值最早到达第4代,促增殖效果好;第7天,BMECG浓度为25μg/L时,第7代荧光值达到最多,促增殖效果最为显著。继续增加BMECG浓度对NSCs的促增殖作用没有帮助。2.基因芯片结果显示BMECG给药组NSCs与模型组相比,引起表达差异2倍以上基因共1043个,其中表达上调基因463个,表达下调基因580个。差异基因主要参与细胞增殖分化、转录调控等相关生物进程。部分差异基因存在于Notch、Wnt、MAPK、CAMP等通路中,这些通路均与NSCs增殖调控相关。该实验结果为深入研究B-BMECG促NSCs增殖的分子机制的提供重要的靶点。3.建立全脑缺血模型后,小鼠脑组织发生了明显地缺血改变,导致神经元水肿、核固缩,并导致神经功能损伤。与模型组相比,BMECG各组及阳性药组均能够增加小鼠平衡转棒仪在棒时间,其电以中剂量组对缺血后小鼠的行为学改善情况最为显著;HE病理染色显示BMECG各组的缺血病理状态相对于模型组有明显地改善(p<0.01);在给药第7天,BMECG各组可以提高缺血脑组织皮层内Nestin阳性细胞的表达,促进大脑皮层NSCs的增殖。4.通过对小鼠大脑皮层组织进行RT-PCR检测,得到如下结果:相对于模型组,BMECG干预组给药第7天时基因Notch1、Musashi1 mRNA表达升高,Numb mRNA表达降低,且具有统计学差异。其中BMECG高中剂量组相对于阳性药组的变化趋势更加显著。结论:综上所述,本实验首次将蒙药白脉散有效成分组应用于NSCs保护及促增殖能力研究,并对其机制进行初步的探索。BMECG在一定浓度下具有显著的体内外抗缺糖缺氧损伤、促NSCs增殖能力。BMECG的抗脑卒中神经病变药效可能通过Notch、Wnt、MAPK等通路起效,其中在Notch通路中Musashi1-Numb-Notch路径可能起到关键性作用。本课题获得了 BMECG研究的关键实验数据,为民族大复方药效物质基础研究提供新的靶点和思路。