第一部分：LPCAT1缺陷引起小鼠视网膜变性的实验研究　　目的：　　rd11小鼠是溶血卵磷脂酰基转移酶 1 （Lpcat1）基因自然突变后， LPCAT1 蛋白缺陷的动物模型之一。本部分主要观察该基因突变对小鼠视网膜结构和功能的影响，即rd11小鼠视网膜表型。　　方法：　　实验动物分为rd11（Lpcat1自然突变）及其背景品系C57BL/6J小鼠，根据适当的年龄跨度，分别实施眼底照相、眼底荧光血管造影（FFA）和视网膜光学相干断层扫描（OCT）检查，对活体状态下小鼠视网膜形态进行观察。在功能方面，实施全视野闪光视网膜电图（ERG）和视行为测试。最后处死动物，对基因突变引起的视网膜组织结构和生理生化等方面的改变进行分析。　　结果：　　免疫组化证实了rd11小鼠视网膜表达LPCAT1存在缺陷；然而野生型（WT）C57BL/6J视网膜存在LPCAT1强阳性表达，后者主要位于光感受器内节。由于LPCAT1缺陷，rd11视网膜发生早期变性，4周龄时光感受器细胞核的层数较WT减少将近50%；至8周龄，视网膜外核层（ONL）仅残留≤1层的细胞核。视网膜OCT像（活体状态下），也显示ONL厚度从2周龄的(45.2 ± 4.0) μm急剧下降至10周龄的(1.2 ± 1.6) μm (P ＜ 0.001)。TUNEL染色提示rd11视细胞发生了凋亡，与感光功能相关的杆体视色素和锥体视蛋白，也随着细胞凋亡而丧失。rd11小鼠1～8月龄，眼底还表现为色素斑沉着、视网膜血管变细和一些小血管渗漏等病理改变。功能方面，rd11视杆系统ERG的幅值在4周龄时明显下降，6周龄时视锥系统ERG也仅残留微弱反应，8周龄时全视网膜电生理反应几乎完全丧失。视网膜变性后，视行为学检测也客观证实了rd11小鼠存在视功能障碍。　　结论：　　小鼠LPCAT1缺陷可导致视网膜早期快速变性，表型同临床上原发性视网膜色素变性比较类似。　　第二部分：衣壳蛋白突变的AAV8载体治疗rd11视网膜变性的实验研究　　目的：　　Lpcat1基因自发突变可导致视网膜早期快速变性，rd11小鼠是其动物模型之一。本研究以衣壳蛋白突变的AAV为载体，介导外源Lpcat1基因，在rd11视网膜上尝试基因治疗。　　方法：　　初选AAV2(Y444,500,730F)和AAV8(Y733F)载体，两者的衣壳蛋白均发生酪氨酸突变，且为各自最优化的突变方式。外源Lpcat1基因在视网膜表达后，比较两载体的短期效果（以 ERG 作为评价指标），从中筛选出疗效更佳的AAV血清型。优选的AAV载体通过视网膜下腔途径，注射14天龄的rd11小鼠；治疗后10周，对视网膜组织结构、相关蛋白表达和视网膜功能等方面进行全面评估。　　结果：　　基因治疗短期效果显示，AAV8(Y733F)载体明显优于AAV2(Y444,500,730F)。选择AAV8(Y733F)治疗后10周，rd11小鼠ERG反应得以相当程度的保留，幅值接近同龄WT小鼠水平的70%左右；然而rd11未治疗眼则无法诱导出有用的电生理反应。形态学上，rd11治疗后视细胞的重要结构如ONL和外节（OS）等均得到较好的保留。LPCAT1 在光感受器中恢复表达后，杆体细胞特异性Rhodopsin和锥体特异性Opsin也得以保留，并能发挥感光功能。水迷宫实验提示，rd11治疗组视行为基本维持正常。另外，基因治疗也抑制或延缓了rd11视网膜微血管的退行性变。　　结论：　　针对一些外层视网膜变性发生早、进展快的小鼠模型，视网膜下腔基因治疗选择AAV8(Y733F)载体比AAV2(Y444,500,730F)可能更加有效。　　第三部分：rd11小鼠不同日龄行视网膜下腔基因治疗的效果比较　　目的：　　在视网膜光感受器中，LPCAT1 是细胞内膜性结构磷脂成分合成的关键酶。由于Lpcat1基因自发突变，rd11小鼠表现为早期快速的视网膜变性。rd11小鼠分成多个天龄组，通过视网膜下腔注射AAV转基因载体，本研究探讨基因治疗最佳时机以及治疗推迟是否仍然有效。　　方法：　　rd11小鼠分成10、14、18和22天龄四组，通过视网膜下腔途径进行基因治疗，注射的转基因载体为AAV8(Y733F)-smCBA-Lpcat1。治疗后4个月，对不同天龄注射组的效果进行比较，观察指标涉及视网膜结构、相关蛋白表达和视网膜功能等方面。　　结果：　　rd11小鼠10天龄组基因治疗后4个月，注射区附近的视网膜厚度得以保持在WT小鼠水平的83%；但AAV载体在眼底视网膜的转染范围比较有限，仅占全视网膜的30%。小鼠14天龄时，视细胞外节与RPE比较容易脱离，此时注射的载体溶液在视网膜下腔能广泛扩散，AAV 转染有效区达眼底全视网膜的80%；该组如果在治疗后的关键期给予适当避光处理，则基因治疗能够挽救更多的视细胞及其功能。对于rd11小鼠，基因治疗如延迟到18天龄进行，则只能挽救一部分中波长敏感的视锥细胞，而对短波长敏感的视锥细胞完全无效。　　结论：　　小鼠视网膜变性的基因治疗，选择在视网膜病变不同阶段进行，对疗效影响很大。针对rd11视网膜变性，基因治疗最佳时机是在小鼠14天龄。与短波长敏感视锥细胞相比，中波长敏感视锥细胞具有更宽的治疗有效期。