寡肽类药物具有疗效好、安全性高、耐受性强等药理优势,及药品上市周期短、易于合成等商业优势,是重要的药物组成部分。从两千多年前阿胶的应用,到近年水蛭素的制备和大豆多肽的上市,中药蛋白和生物活性肽的应用具有悠久的历史和确切的药理药效、临床数据。研究表明,无论是来源于陆地还是海洋的常用植物、动物和菌类中药,均含有较为丰富的蛋白多肽类成分,是研究寡肽类药物的良好载体。相比于提取分离、发酵酶解等传统中药寡肽获取手段,利用计算机辅助水解可更高效地获得中药寡肽。计算机辅助水解是基于生物信息学方法,探讨蛋白质序列在给定条件下,被特定蛋白酶或化学物质切割的位点预测技术。通过模拟消化道的虚拟水解,可构建中药寡肽数据库,探索中药活性寡肽的化学结构;进一步借助分子模拟及生物网络技术,可系统解析中药寡肽的作用机理。本文以六味禾本科种子类中药及两味介壳类海洋中药为研究载体,深入探讨计算机辅助水解技术在中药蛋白及活性肽研究中的应用,构建禾本科种子类中药及介壳类海洋中药寡肽数据库。随后,以7个降压调脂关键靶标为研究对象,以药效团和分子对接等分子模拟技术为研究手段,辨识具有降压调脂药效的中药化学成分及中药生物活性肽。进一步结合蛋白互作网络技术及多靶点筛选研究,解析中药寡肽的多靶点降压调脂作用机理。最后,结合生物学实验及分子动力学模拟,验证部分中药寡肽的生物学活性,从而形成基于计算机辅助水解和虚拟筛选相结合的体现“干湿结合”特色的寡肽类中药设计研究方法。1.中药寡肽数据库的构建本文基于计算机辅助水解技术开展中药寡肽数据库的构建研究。禾本科种子类中药多味甘、归脾胃经,具有健脾益胃之功效,通常具有较为丰富的蛋白含量,是研究中药植物蛋白的良好载体。介壳类海洋中药多味咸、归肝肾经,具有软坚散结之功效,也具有丰富的蛋白含量,是研究中药动物蛋白的良好载体。本文首先收集具有较高蛋白含量的六味禾本科种子类中药,薏苡仁、麦芽、粳米、小麦、高粱和玉米,及两味介壳类海洋中药牡蛎壳和珍珠母的蛋白序列,主要包括禾本科种子类中药储存蛋白的醇溶蛋白和谷蛋白序列、牡蛎壳的类胶原蛋白序列及珍珠母的珍珠层蛋白序列。利用计算机辅助水解技术,分析蛋白序列的切割位点,采用模拟消化水解的策略,利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶开展模拟水解,基于水解产物构建中药寡肽虚拟肽库。中药寡肽数据库中包括禾本科种子类中药寡肽1180条、牡蛎壳寡肽3523条、珍珠母寡肽458条、大豆寡肽299条,共计4913条中药寡肽。进一步通过构建肽转运体PepT1的底物预测模型,初步预测了中药寡肽的吸收性质,部分阐明了中药寡肽具有吸收入血而发挥药效的基本性质。2.降压调脂相关靶标药效辨识模型的构建为探讨中药化学成分及活性寡肽的降压调脂作用机制,本文以高血压和血脂异常两类常见的心血管疾病为研究载体,进一步构建降压调脂相关靶标的药效辨识模型。根据不同靶标的数据基础及研究目标不同,本文分别探索并创新了多种基于分子模拟技术联用的中药有效成分族群辨识新方法,从而更有针对性的提高基于分子模拟技术的中药有效成分族群辨识的效率和准确性。1)针对血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme,ACE）抑制剂,本文根据其三个典型的蛋白晶体结构,分别构建了三组分子对接模型,并结合其已构建的药效团模型,开展联合的虚拟筛选研究。2)基于血管紧张素受体（Angiotensin Ⅱ Receptor,AT1）激动剂与拮抗剂化学结构相似且结合于相同的活性位点,本文构建了其拮抗剂的配体药效团模型、激动剂的受体药效团模型及拮抗剂的两组分子对接模型,从而筛选能被拮抗剂模型命中,且剔除被激动剂模型命中的中药活性成分,为提高AT1拮抗剂筛选的准确性提供保障。3)为了精准筛选内皮素受体A（Endothelin receptor A,ETA）肽类拮抗剂,本文探讨了肽类药效团模型的构建方法,构建了 ETA肽类拮抗剂的药效团模型,并基于同源模建技术,构建ETA的蛋白三维结构,结合分子对接技术和一致性打分方法,开展具有ETA拮抗活性的中药寡肽的辨识研究。4)针对内皮素受体B（Endothelin receptorB,ETB）蛋白三维结构缺失的问题,本文基于同源模建技术,搭建了 ETB的蛋白三维结构,进一步通过蛋白活性口袋识别,开展分子对接模型构建,从而辨识ETB中药拮抗剂。5)针对过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα）激动剂,本文综合基于配体和基于受体的药效团模型的优势,提出了融合药效团模型的构建思路,并通过比较PPARα激动剂的配体药效团、受体药效团、融合药效团、分子对接、多模型联合筛选的准确性及筛选效率,客观评价本文融合药效团模型的准确性及筛选效率。6)针对酰基辅酶 A:胆固醇酰基转移酶-2（Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase-2,ACAT-2）选择性抑制剂筛选难度大、蛋白同源模性低的数据缺陷,本文设计了联合多种基于配体的药物筛选方法的ACAT-2选择性抑制剂辨识技术,通过引入选择性指数,构建ACAT-2和ACAT-1选择性药效团模型,被ACAT-2选择性药效团命中而不被ACAT-1选择性药效团命中的筛选结果将具有较高的亚型选择性。进一步结合其选择性SVM模型和活性SVR模型精筛辨识结果,从而获得具有潜在选择性及活性的ACAT-2中药抑制剂。3.中药活性成分的多靶点辨识与作用机理解析本文采用基于药效团的反向找靶技术,辨识中药寡肽的作用靶标,并进一步结合其关键靶标的蛋白互作信息,分别构建禾本科种子类中药、牡蛎壳和珍珠母寡肽的蛋白互作网络,基于富集分析,解析其功能模块,并针对其中的降压调脂模块进行深入分析,解析中药寡肽的降压调脂机制。进一步结合ACE/ETB、AT1/NEP和PPARα/PepT1三组靶标组合,探讨具有潜在多靶标活性的中药化学成分及中药活性肽,选取筛选结果排名前200的活性化合物进行结构分析,探讨其与靶标之间的结合模式,挑选潜在的中药活性成分。本文共筛选获得ACE潜在中药抑制剂3个,ETB潜在中药拮抗剂1个,ACE/ETB双靶标中药活性化合物2个。发现AT1潜在中药拮抗剂2个,NEP潜在中药抑制剂2个,AT1/NEP双靶标中药活性化合物2个。获得PPARα潜在中药激动剂2个,探讨了三七-灵芝和三七-丹参药对基于PPARα/PepT1靶标组合的降脂作用机制。筛选获得ETA潜在中药拮抗剂1个,ACAT-2潜在中药抑制剂5个。4.中药活性成分的靶标活性检测及相互作用分析基于筛选获得的中药化学成分及中药活性肽,本文选择ACE、AT1、NEP三个靶标为研究对象,针对获得的潜在中药活性成分进行生物活性验证。采用基于RP-HPLC检测的方法,开展ACE抑制剂的活性评价,获得具有ACE抑制活性来源于薏苡仁的中药寡肽NPATY,其IC50值为61.88μM。同时,本文采用基于钙流检测的AT1拮抗剂活性评价方法,发现来源于中药石花的活性成分BUCM-SRS具有AT1拮抗活性,其IC50值为29.76μM。进一步采用基于荧光检测的方法,发现来源于中药牛靥的活性成分BUCM-JLA具有较好的NEP抑制活性,其IC50为15.67μM。本文进一步针对蛋白复合物体系,开展分子动力学模拟研究,进而解析中药活性成分与靶标的相互作用模式。本项目创新性的将计算机辅助水解技术应用于中药活性寡肽的研究中,提出了基于计算机辅助水解、虚拟筛选和生物网络技术相结合的中药寡肽类药效物质发现及作用机理解析的研究思路,为进一步完善中药有效成分族群辨识技术、揭示中药活性肽的降压调脂作用机制、开展寡肽类中药设计研究提供了重要的技术支撑。