研究背景:周围神经损伤所导致的肢体功能障碍在临床中较为常见。即便是良好的手术治疗,结果往往是恢复不理想,甚至一些患者不能恢复。目前,可用于周围神经损伤术后评价其再生水平的方法只是简单的临床检查,比如肌力的评价、感觉功能检查、Tinel’s征和肌电图,这些检查方法多具有主观性或缺乏准确性。所以,准确地评估周围神经再生水平有助于预测术后恢复的效果。在神经科学领域中一个非常传统的神经解剖示踪技术可以直接观测到神经。传统的神经示踪剂,如辣根过氧化物酶、细菌毒素和荧光染料等,具有一定的局限性,包括耗时的免疫组化步骤、复杂的程序、荧光信号差和易光漂白。目前,有许多研究文献报道关于荧光纳米材料在生物成像和生物医学领域中的应用。根据我们先前关于碳点(碳纳米点、交联柔性聚集体的聚合物点、纳米石墨烯碳核结构的石墨烯量子点)的研究经验,我们在本次研究中介绍了金纳米团簇(AuNCs),其优越的荧光激发/发射波长(红色荧光)克服了组织和细胞的自发荧光,自发荧光是细胞成像和神经示踪领域中的重要特征。对这种纳米粒子感兴趣的原因在于它们优良的光学特征、化学稳定性、低毒、溶解性好、抗光漂白和易于表面修饰。目前半导体量子点被用于生物传感器和生物成像领域。然而,其重金属毒性在临床应用中仍存在较大的局限性。因此,与半导体量子点相比,这些纳米粒子具有的生物相容性更具有前景。本文着重研究其细胞行为、体内毒性和基于金纳米团簇的神经示踪剂的研制。在本项研究中,详细介绍了 AuNCs在大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的行为学特点。用于研究纳米粒子的细胞摄取机制和内吞途径的工具包括共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞仪(FACS)。然后,利用不同的内吞标记和细胞器特异染料,通过CLSM观察可研究细胞内的运输机制、亚细胞器分布和共定位,同时通过透射电子显微镜(TEM)可以直接观察到纳米粒子在细胞内的超微结构。我们的研究结果显示,AuNCs具有低毒性和在神经细胞内的有效内化。其细胞摄取具有剂量、时间和能量依赖性。它们主要分布在溶酶体结构内,但是未在细胞核内观察到。在证明AuNCs在体内、体外低毒性后,基于它们的细胞学行为,通过其与霍乱毒素B亚单位结合研制出用于神经示综的荧光生物探针。霍乱毒素B亚单位是一个无毒的传统神经示踪剂。通过EDC/NHS反应将霍乱毒素B亚单位和金纳米团簇连接在一起。作为逆行神经示踪剂的应用证明,它可以在大鼠周围神经系统的神经元内逆行运输。材料与方法:研究的第一部分内容是关于AuNCs在大鼠嗜铬细胞瘤细胞(高分化PC12)的生物学行为。微小的AuNCs通过刻蚀技术和电化学交换反应将谷胱甘肽包裹AuNCs的表面。应利用Synergy HT Microplate reader通过MTT实验检测PC12细胞在不同浓度的AuNCs的细胞毒性,从0.025mg/ml-0.3mg/ml分别孵育24h,48h和72h。细胞培养:PC12(高分化)在加有100%FBS、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM中培养,在37℃和5%CO2的条件下孵育。PC12细胞种植于96孔板培养皿,每孔约1x104个细胞,在37℃和5%CO2的条件下孵育进行MTT实验。通过FACS研究细胞摄取的机制,PC12细胞在6孔板培养,每孔约5 x 105个细胞;利用CLSM研究时,1 x 104个细胞培养于35mm激光共聚焦培养皿(GBD)。然后,对于AuNCs,的摄取机制和内吞途径的研究,浓度按0.2mg/ml在PC12细胞中孵育规定的时间。研究工具包括激光共聚焦显微镜(CLSM),流式细胞仪(FACS)。利用不同的内吞标记物和细胞器特异性染料通过CLSM研究细胞内运输,亚细胞器分布和共定位。细胞器特异性染料包括LysoTracker Green和MitoTracker Green,他们分别标记溶酶体和线粒体。最后,AuNCs在PC12细胞孵育72h,制作电镜标本,并通过透射电子显微镜(TEM)观察。研究的第二部分是关于AuNCs活体毒性,在应用于活体之前先研究它的生物相容性。雄性Wistar大鼠,体重为220-280g。15只大鼠分成三组(每组五只),其中,低剂量组和高剂量组分别为注射0.2ml的50mg/ml和100mg/ml的AuNCs,通过腹腔注射,连续注射7天。对照组为注射0.2ml的氯化钠盐水。监测大鼠体重和活动的改变。大鼠在第八天用10%的水合氯醛麻醉,腹主动脉抽血进行血液生化学检测。切取脑、心、肾、肝、脾、肺后,通过组织切片和苏木精-伊红染色进行组织学检查。研究的第三部分是关于AuNCs作为神经示踪剂的应用。首先,进行体内荧光摄取和稳定性试验,11μL的AuNCs(10mg/ml)在Wistar大鼠股部中点直接注射到坐骨神经外膜下。大鼠分别在注射后7天和28天猝死。坐骨神经注射位点取材,制作切片,利用荧光显微镜在UV激发下进行观察。然后,霍乱毒素B亚单位,一个非毒性的传统神经示踪剂被应用于连接AuNCs。通过EDC/NHS反应将霍乱毒素B亚单位与金纳米簇结合(CTB-AuNC)。CTB-AuNC的结合和性质通过SDS-PAGE凝胶电泳,FTIR,紫外吸收光谱和Zeta电位实验检测。最后,结合后的CTB-AuNCs应用于逆行荧光纳米神经示踪剂。成年Wistar大鼠用水合氯醛麻醉,大鼠双侧股部暴露后分离坐骨神经,右侧坐骨神经神经外膜下注射5μL 1%CTB-AuNCs,,左侧坐骨神经作为对照组于神经外膜下注射5 μLof 1%生理盐水。CTB-AuNCs注射后6天,大鼠用10%的水合氯醛麻醉,通过左心室0.9%氯化钠盐水灌注1小时和4%多聚甲醛灌注2小时。双侧L4和L5背根神经节和脊髓腰段取材,置于4%多聚甲醛3～4小时,然后放置在30%蔗糖的PBS缓冲液中过夜。20μ米厚的L4和L5背根神经节,坐骨神经注射部位和注射部位接近背根神经节处采用冰冻切片机纵切,然后在荧光显微镜下(Olympus BX51)采用紫外激发模式观察CTB AUNC荧光。阳性结果为CTB AuNCs在背根神经节和注射部位以近部分可以观测到荧光成像,并行免疫组织化学染色,切片在光学显微镜下观察。结果:AuNCs的制备是在Ag纳米粒子与谷胱甘肽(GSH)配体制备后,然后通过电流交换反应,与HAuC14刻蚀反应。合成的荧光AuNCs通过透射电子显微镜(TEM)观察其形态。合成的AuNCs荧光颗粒大小呈球形,均匀,平均粒径小于2.5纳米。高分辨透射电子显微镜显示2.35A晶格间距。由于配体GSH形成了具有优良稳定性的Au-S键作为保护层,使纳米颗粒没有形成较大纳米尺寸和聚集。在PC12细胞中AuNCs的细胞毒性:在浓度25,50,100,200和300μg/mL的AuNCs下分别孵育24h和48h,细胞的存活率在200μg/mL时仍维持在90%以上,细胞的存活率在300μg/mL时仍维持在80%以上。在同样的浓度下,孵育较长时间达72h,细胞的存活率在200μg/mL时仍维持在80%以上,存活率在300μg/mL浓度时下降。AuNCs的细胞内摄取和亚细胞器分布:PC12细胞和不同浓度AuNCs培养72h后,测量平均荧光强度,显示AuNCs的平均荧光强度与浓度(50-200μg/mL)呈线性相关,分别用FACS和CLSM检测。AuNCs在亚细胞器的分布显示AuNCs主要运输到溶酶体,与LysoTracker green特异性共定位。然而,AuNCs与MitoTracker green却没有共定位。这个现象证明了 AuNCs的亚细胞器分布主要是溶酶体。通过TEM观察PC12细胞的超微结构的摄取和分布。TEM图像显示,细胞膜通过晶格的形式包裹AuNCs(密度反差粒子),这表明细胞内吞作用是存在的。此外,在胞浆内吞小泡或早期内涵体的形成,并在这些结构中可观察到电子密度颗粒的AuNCs。体内毒性试验结果:AuNCs毒性的体内毒性研究是通过成年雄性大鼠完成的。他们的活动、进食和饮水习惯,皮肤颜色改变和精神状态在所有组别内正常,并且没有死亡。此外,对照组和实验组在体重方面没有明显的差异。分析血常规、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板计数等常见指标。这些血细胞分析指标差异没有统计学意义,表明AuNCs对大鼠血细胞无明显毒性作用。血清生化检查显示肝功能指标,包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白、球蛋白,在三组变化均在正常范围内,提示所有组大鼠肝功能是正常的。肾功能指标差异无统计学意义,如血清肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、尿酸(UA),这表明AuNCs对肾功能无明显损害。各主要脏器组织学检查显示在连续给药AuNCs(50mg/kg和100mg/kg)7天后肝脏,脾,肾,肺,大脑和心脏无明显的病理变化。即使在AuNCs100100mg/kg较高浓度下,体内的毒性与对照组比较仍不显著,表明其较好的生物相容性和良好的临床应用前景。CTB-AuNCs的结合和表征结果:通过TEM检测分析的形态和结构表明,新合成的CTB AuNCs复合物的平均尺寸约为5.5 nm,明显大于2.5 nm的单AuNCs,颗粒尺寸变得不均匀,纳米颗粒聚集形成一个较大的颗粒。这是由于Au纳米粒子表面丰富的GSH配体。多个CTB与AuNCs结合,与透射电镜照片观察到的结果一致。在确定了 CTB-AuNCs结构后,其光学性能的进一步检查表明CTB-AuNCs复合体的荧光光谱的最佳激发波长是467nm。在这个激发波长激发下,其发射波长为607nm,表明Au纳米粒子的荧光峰在结合CTB后没有改变。合成的CTB-AuNCs溶液澄清透明,分散。紫外光下,溶液出现明亮的红色荧光,表明CTB AuNCs复合体保持原来的AuNCs荧光性质。SDS-PAGE表明CTB-AuNCs紫外光照射下在10kDa和15 kDa之间呈强荧光信号带。CTB的分子量为11.6kDa,AuNCs在紫外光照射下能发出强烈的荧光,所以此带可以证实CTB-AuNCs成功的结合。AuNCs体内荧光稳定性结果:10 μL AuNCs(10mg/ml)注射在左侧股部坐骨神经中点神经外膜下。7天之后,左、右坐骨神经切除,固定,并用冰冻切片机切取20μM组织切片制作冰冻切片。组织切片移置在载玻片上,在紫外光激发下用荧光显微镜观察。坐骨神经对照组观察为蓝色荧光,注射AuNCs的坐骨神经观察为明亮的红色荧光神经纤维。AuNCs荧光的长期维持的检测试验:经过28天的AuNCs注射的坐骨神经,行坐骨神经注射部位冰冻切片并用荧光显微镜观察,可见明亮的红色荧光神经纤维,证明注射部位仍可有AuNCs沉积。CTB-AuNCs作为PNS逆行神经示踪剂的结果:5 μL of 1%CTB-AuNCs注射在右股部坐骨神经的中点。5 μL 0.9%生理盐水在左侧坐骨神经同样水平位置注射作为对照。6天之后,左、右坐骨神经和L5背根神经节(DRG)切除后行冰冻切片,CTB-AuNCs注射部位和近神经根部位呈亮红色荧光。此外,CTB-AuNCs荧光信号虽然在L4DRG观察很少,却表明坐骨神经的传入纤维进入脊髓通过L4和L5神经根。此外,CTB-AuNCs标记的神经元可以在右侧的L3-L5纵剖面发现。为了证实CTB-AuNCs荧光信号,荧光阳性切片用于进一步的CTB的免疫组化染色。结果与CTB-AuNCs荧光信号的分布一致。对照坐骨神经侧在紫外光激发下,除了正常的蓝色自发荧光外没有其他任何的荧光。作为逆行示踪剂的应用表明,它可以逆行运输到大鼠的周围神经系统的神经元。结论:在这项研究中,我们已经研究了细胞的生物学行为,在体外和在体内的毒性以及与CTB结合(CTB-AuNC)作为纳米神经示踪剂的应用潜能。AuNCs的重点是超微结构、可调节、使红色荧光(更高的发射波长)接近近红外区、毒性低、生物相容性好、高的光稳定性和抗光漂白,这些特点使其优于传统的有机染料和我们之前研究的碳点和最近研究热门的量子点。首先,AuNC细胞摄取具有剂量依赖性和时间依赖性,摄取的AuNCs运输主要通过早期和晚期内涵体运输到溶酶体。细胞的摄取较为缓慢,可能由于它与细胞膜表面的蛋白之间的相互作用导致的,此现象存在争议。其次,AuNCs体内毒性结果表现为低毒性,这是对于任何新的纳米材料动物成像中的应用的重要前提。体内的AuNCs荧光稳定性可被四周的体内荧光证明。第三,霍乱毒素B亚单位(一种逆行运输的神经多肽)与AuNCs连接,应用它作为一种新的基于AuNCs荧光的荧光神经示踪剂。谷胱甘肽修饰的AuNCs具有很强的荧光强度、超小尺寸、稳定的光学和化学性能、易于表面修饰、细胞毒性低、生物相容性好。因此,它适合于荧光标记,但没有神经源性特异性,所以我们选择了霍乱毒素B亚单位(CTB)为载体,结合CTB与AuNCs。新的荧光纳米神经示踪剂(CTB-AuNCs)通过与AuNCs结合制备,注射于大鼠股部坐骨神经水平,可以被PNS外周神经元摄取,并运输到神经元的细胞体。在CTB-AuNCs注射后6天,荧光信号出现在L4、L5背根神经节,并且经免疫组化进一步证实。我们得出结论,CTB-AuNCs有较强的荧光信号,光稳定性好的优点,较长的储存时间和较低的毒性。它是一个简单、直接、经济的逆行示踪技术。AuNCs的荧光发射光谱为红色荧光,它是相比我们以前关于碳纳米点研究的主要优势。它可以避免身体组织发射的蓝色自体荧光,并提供更好的对比度和改善信噪比。CTB-AuNCs是一个潜在的逆行荧光纳米神经示踪剂,可进一步用于结合不同的荧光纳米颗粒来创建多种颜色的荧光神经示踪剂。