目的:黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种具有强致癌性、致畸性和遗传毒性的物质,本研究所已经分离出一种产黄曲霉素解毒酶（ADTZ）的真菌E20,并对其进行基因克隆和重组表达,得到了重组黄曲霉毒素解毒酶（rADTZ）。rADTZ为一新发现的氧化酶,其一级序列与已知蛋白具有较低的同源性,对该酶的研究具有重要的理论和实践意义。实验室前期的工作成功将黄曲霉毒素解毒酶基因克隆到含有融合标签MBP的pMAL—C2X载体并在大肠杆菌中进行重组诱导表达,表达效率较高,但活性不理想。本研究将原核表达的rADTZ经尿素变性,然后尝试不同的复性条件,以期望获得高纯的、高活性的rADTZ蛋白,为进一步对rADTZ结构及功能的深入研究奠定基础。方法:采用亲和层析纯化融合蛋白MBP rADTZ,Factor Xa酶切融合蛋白MBPrADTZ,制备高纯的MBP及rADTZ蛋白混合液,经尿素变性后,以各种复性缓冲液进行复性。探讨的复性条件包括:酸碱性、氧化还原性、糖类、氨基酸、无机盐、表面活性剂等,利用辣根过氧化物酶（HRP）测活系统筛选出有活性的样品组。分子筛SuperoseTM12 10/300 GL分子筛层析方法对复性后的酶蛋白进行了纯化,并测量其表观分子量,圆二色光谱法测量rADTZ的二级结构,等温滴定微量热法（ITC）对可能与rADTZ结合的金属离子进行确认,并对其可能的作用机制做了探讨。结果与结论:经过复性条件的筛选,确定了较优的复性方法:复性样品蛋白含量为7.3μg/组,复性温度为4℃,基础复性缓冲液的组成为0.02M Na2HPO4-0.01M柠檬酸（pH5.8）,可加入的[GSH]/[GSSG]及添加剂有以下两种:①变性过程中不加入EDTA时,复性时[GSH]/[GSSG]=1:1,复性剂为0.1M NaCl+10%甘油+Arg/Glu（50mM/10mM）+0.05MPro,在第1-3天时均可测到活性;②变性过程中加入EDTA时,复性时[GSH]/[GSSG]=3:1,复性剂为Arg/Glu（50mM/10mM）+0.05mM Zn2+,分别在第2、3天测到活性;复性结果rADTZ对AFB1转化率分别为63%和39.6%,酶活分别为135U/mL和85U/mL。可能的作用机制是:复性过程中氯化钠的加入使rADTZ的可溶性增加,减少了复性时聚集体产生的几率;而氨基酸的加入不仅抑制了热变性过程中蛋白质的聚集,而且可以诱发伸展肽链产生α—螺旋和正确的三级结构。分子筛SuperoseTM12 10/300 GL层析方法对复性后的酶蛋白进行了纯化,得到了一条电泳纯大于95%的条带,并测量了rADTZ的表观分子量,约为76KD,表明有活性的rADTZ为一单体;圆二色光谱法测量其二级结构,结果为α—螺旋为39.4%、β-折叠为10.2%、β—转角为13.7%和无规则卷曲为36.7%,测定结果与生物信息学预测的结果基本一致;等温滴定微量热法（ITC）提示rADTZ与Zn2+有结合作用,证实了生物信息学中关于ADTZ有可能存在一个锌指结构的推测,同时锌指结构提示ADTZ有可能存在一个水解功能区。综合本实验结果以及前期的研究工作,可以推测ADTZ可能是一个氧化-水解的双功能酶,一级序列中的两个半胱氨酸不形成分子内或分子间的二硫键,第502位半胱氨酸位于锌指结构域中,参与Zn2+的结合。