脊髓损伤这一严重致残的重大伤病目前仍是世界性难题,其病理学基础主要是直接或间接的损伤导致轴突变性和神经元坏死。成人脊髓损伤后,微环境的破坏致使中枢神经再生困难。近几十年来,大量实验证明中枢神经在合适的环境中可以再生,让我们看到了让脊髓损伤截瘫病人站起来的希望。然而,由于脊髓损伤病理改变的复杂性,其治疗效果一直欠佳。新近的观点多认为,联合治疗的方法,如神经营养因子和神经生物材料联合,有望达到更好的疗效。其中,神经营养因子因其可以提供营养和生长引导信号而倍受关注,而脊髓损伤后神经营养因子自身的不足使外源性给药十分必要。然而目前的研究表明,由于外源性给药方式的缺陷(如扩散及损伤区药物有效浓度维持),使得神经营养因子的广泛应用受到了限制。移植分泌营养因子的细胞可能导致免疫排斥反应；病毒载体安全性的问题还未被真正解决；微渗透泵的方法可能导致感染发生。因此,亟需找到一种理想的运载神经营养因子的方法。神经营养因子-3(neurotrohin-3,NT3)是神经营养因子家族中对促进中枢神经再生非常重要的因子,尤其是对中枢神经系统中的重要通路之一——皮质脊髓束的再生起着关键作用。通过组织工程学对NT3进行改造,使之以化学键牢固结合于神经生物材料上,使之在损伤灶区域发挥更有效的作用。本研究将构建带有胶原结合区和层粘连蛋白结合区的NT3,通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)检验新构建因子的结合能力,通过细胞学方法研究这些重组蛋白的生物学活性。高分子材料——聚乳酸聚乙醇酸共聚物(Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)和胶原支架是两种广泛应用并且适用于脊髓损伤治疗的生物材料。PLGA是经美国食品和药物管理局认证的生物材料。本研究利用的多通道PLGA神经导管支架可以重建脊髓结构,引导神经生长,从而促进脊髓损伤修复。本课题拟利用这一生物支架与重组NT3联合治疗脊髓损伤,观察其治疗效果。胶原材料可以作为连接损伤脊髓头端和尾端的物理桥梁,也可以成为运输NT3的载体。胶原材料因其容易获取、具有良好的可塑性和生物相容性,而广泛应用于脊髓损伤的修复研究中。本研究在中科院遗传与发育研究所研制的有序胶原材料基础上,以大鼠鼠尾韧带为原材料,制做了一种适用于基础研究的纤维性胶原支架。它机械强度好,保持了天然的纤维排列,可以支持细胞生长,能够定向引导神经迁移；可以结合神经生长因子,能够构建运载药物的良好体系。本课题将利用这一纤维性有序胶原支架与带有胶原结合区的NT3联合治疗脊髓损伤。第一章：重组NT3及其衍生物的获取和功能分析目的：利用组织工程学技术重组NT3,通过对NT3的基因改造构建胶原靶向NT3和层粘连蛋白靶向NT3,并通过蛋白表达、复性和纯化获取这三种NT3,为进一步联合治疗脊髓损伤建立基础。方法：从人脑组织中提取基因组cDNA,利用设计好的NT3成熟肽的上下游引物扩增NT3成熟肽的编码序列nt3,与带有组氨酸亲和标签的质粒pET28a重组成pET28a-nt3。同时,在组氨酸亲和标签和nt3之间连接胶原结合区(collagen binding domain, CBD)和层粘连蛋白结合区(laminin binding domain, LBD),构建pET28a-CBD-nt3和pET28a-LBD-nt3。NT3、胶原靶向NT3和层粘连蛋白靶向NT3在大肠杆菌中诱导表达后,经过菌落收集、超声破碎、洗涤、溶解等多个步骤在包涵体中最后表达。得到的三种因子分别进行蛋白的胶原结合实验和层粘连蛋白结合实验,并分别绘制胶原结合曲线图和层粘连蛋白结合曲线图。从孕15天的胚鼠中获取背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),利用NT3能维持神经元存活和促进DRG轴突生长,以DRG和消化后的DRG细胞进行因子的定性和定量活性检测。最后,体外培养DRG细胞,分别检验三种因子在胶原蛋白和层粘连蛋白上的维持神经元存活和促进DRG轴突生长的能力,验证胶原靶向NT3和层粘连蛋白靶向NT3的体外功能活性。结果：基因序列正确的nt3分别连接胶原结合区和层粘连蛋白结合区,获取重组的nt3并成功构建带有胶原结合区和层粘连蛋白结合区的nt3。蛋白经诱导表达后,在聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上大约15.49Kd、17.69Kd和31.88Kd的位置出现三个条带；复性、纯化后亦可见纯度较高的此三种蛋白；Western Blotting结果证明这三种蛋白的确正确表达。由结合曲线图可知,在0-10μM浓度范围内,胶原靶向NT3具有比NT3更高的胶原结合能力(P<0.01)；在0-10μM浓度范围内,层粘连蛋白靶向NT3具有比NT3更高的层粘连蛋白结合能力(P<0.01)。定性和定量活性实验表明,胶原结合的NT3和层粘连蛋白结合的NT3与NT3相比,其活性没有下降。体外功能实验证明,胶原蛋白能结合更多的胶原蛋白靶向NT3,从而发挥更好的维持神经元存活(P<0.05)和促进DRG轴突生长(P<0.01)的功能；层粘连蛋白能结合更多的层粘连蛋白靶向NT3,从而发挥更好的维持神经元存活(P<0.05)和促进DRG轴突生长(P<0.05)的功能。结论：所用的蛋白表达、复性、纯化方法方便易行。新构建的胶原靶向NT3和层粘连蛋白靶向NT3不仅活性没有下降,而且具有更高的结合能力。这种结合不单是物理方式的结合,更有化学键的结合。体外功能实验证明,胶原蛋白能够结合更多的胶原靶向NT3,层粘连蛋白也能够结合更多的层粘连蛋白靶向NT3,从而发挥更好的生物功能。第二章：联合运用PLGA和NT3修复脊髓损伤目的：联合运用新制作的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和重组NT3治疗大鼠全横断脊髓损伤,验证这种联合方法的可行性和治疗效果,为今后的治疗策略提供参考。方法：制做大鼠T8-T10全横断脊髓损伤模型,分组移植PLGA和NT3,术后给予大鼠悉心照料,养育16周后将大鼠灌注处死。整个实验期间,通过Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)评分和斜坡实验正确步态百分比的计量,对大鼠运动功能进行监测和比较。灌注处死前18天每组随机选取健康大鼠各5只,在大脑感觉运动皮层(前囟前2mm,中线旁2mm以内)注射顺行追踪剂；灌注处死前10天再随机选取健康大鼠每组各5只,脊髓横断处以下10mm处注射逆行追踪剂；灌注处死前全部大鼠行皮层感觉诱发电位的电生理测试,刺激坐骨神经,在大脑感觉运动皮层记录电反应。将大鼠灌注处死后,分离脊髓组织,冰冻切片。通过神经丝染色和神经胶质原纤维酸性蛋白染色,观察、分析新生神经纤维穿越胶质疤痕和移植物的生长情况,计数神经丝染色阳性面积。利用辣根过氧化物酶显示顺行追踪剂阳性神经纤维,计数其迁移距离和阳性面积。逆行追踪大鼠的脊髓组织切片直接观察、拍照,计数逆行追踪剂阳性纤维的迁移距离和阳性面积。结果：联合运用PLGA和NT3的治疗组大鼠,BBB评分结果有比较明显的提高,尤其在术后7周内提高更迅速,7周后评分结果进入缓慢甚至平台期。未治疗组、单纯NT3组、单纯PLGA组BBB评分结果在曲线中呈持续缓慢上升趋势。假手术组大鼠术后1周即开始表现出与正常大鼠相似的运动功能,BBB评分为21分。PLGA和NT3联合治疗组的BBB分数在7周、12周、16周显著高于未治疗组(P<0.05)、单纯NT3组(P<0.05)和单纯PLGA组(P<0.05)。术后32天、60天、150天斜坡实验正确步态百分率结果表明,PLGA和NT3联合治疗组爬斜坡的能力好于未治疗组(P<0.05)、单纯NT3组(P<0.05)和单纯PLGA组(P<0.05),且具有显著差异。BBB评分和斜坡实验说明了各组功能重建的结果,而免疫组化、顺行追踪结果、逆行追踪结果等形态学结果则证明了组织和纤维结构生长、连接情况。免疫组化结果还可见,PLGA和NT3联合治疗组的损伤灶胶质疤痕少,神经纤维可以长入移植物；而未治疗组胶质疤痕较多,单纯NT3和单纯PLGA组损伤灶处神经纤维较少；计数神经丝阳性面积,PLGA和NT3联合治疗组的结果显著大于未治疗组(P<0.05)、单纯NT3组(P<0.05)和单纯PLGA组(P<0.05)。顺行和逆行追踪结果表明,PLGA和NT3联合治疗组中,顺行和逆行追踪剂可以穿越移植物迁移,其迁移距离和阳性面积均显著大于未治疗组(P<0.05)、单纯NT3组(P<0.05)和单纯PLGA组(P<0.05)。但电生理结果表明,未治疗组、单纯NT3组、单纯PLGA组及PLGA和NT3联合治疗组的大鼠都未引出皮层感觉诱发电位,暗示再生神经的有限。结论：PLGA和NT3联合治疗脊髓损伤,不仅能为损伤后的神经生长提供物理支持,更能提供适宜的微环境以促进轴突生长。经过PLGA和NT3的联合治疗,损伤后的大鼠运动功能部分恢复。这种新制的PLGA具有孔隙率高、连结性好的特点,有利于神经营养因子的进入,与神经营养因子发挥协同作用,能够更好地促进脊髓损伤的修复。第三章：胶原靶向NT3结合有序胶原支架修复脊髓损伤目的：制作新型的适合脊髓的有序胶原材料,检验此生物支架结合胶原靶向NT3体系发挥的治疗脊髓损伤的作用。有望为以后的治疗脊髓损伤提供新方法,为今后的治疗方案提供指导作用。方法：制做大鼠T8-T10全横断脊髓损伤模型,分组移植有序胶原支架和胶原靶向NT3,术后给予大鼠悉心照料,养育16周后将大鼠灌注处死。16周内,对大鼠进行运动功能监测,通过BBB评分和斜坡实验错误步态百分比的计量,比较各组运动功能恢复的情况。灌注处死前18天每组随机选取健康大鼠各5只,大脑感觉运动皮层相对固定位置(前囟前2mm,中线旁2mm以内)注射顺行追踪剂。将大鼠灌注处死后,分离脊髓组织,冰冻切片。通过神经丝染色和神经胶质原纤维酸性蛋白染色,观察神经纤维穿越胶质疤痕和移植物的生长情况,计数神经丝染色阳性面积。计数5羟色胺神经纤维染色阳性面积。利用辣根过氧化物酶显示顺行追踪剂阳性的皮质脊髓束纤维,计数损伤灶尾端5mm以内再生皮质脊髓束纤维的阳性面积。结果：有序胶原支架+胶原靶向NT3治疗的大鼠BBB评分结果在术后16周不断提高,提高幅度和速度均比较明显,与未治疗组(P<0.05)、单纯胶原靶向NT3组(P<0.05)、有序胶原+PBS组(P<0.05)和有序胶原+NT3组(P<0.05)相比有显著性差异；未治疗组BBB评分结果基本无提高；单纯胶原靶向NT3组、有序胶原+PBS组和有序胶原+NT3组的BBB评分结果在曲线中呈持续缓慢上升趋势。假手术组大鼠术后1周即开始表现出与正常大鼠相似的运动功能。术后32天-150天的斜坡实验正确步态百分率结果表明,有序胶原支架+胶原结合NT3治疗组大鼠爬斜坡的能力好于未治疗组(P<0.05)、单纯胶原结合NT3组(P<0.05)、有序胶原+PBS组(P<0.05)和有序胶原+NT3组(P<0.05),且具有显著性差异。BBB评分和斜坡实验表明①单纯有序胶原对治疗脊髓损伤有益②有序胶原+胶原靶向NT3组大鼠功能恢复比有序胶原+NT3组大鼠好,且具有显著性差异,说明胶原靶向NT3能够更好地结合在有序胶原上而发挥更有效的治疗作用。神经丝、顺行追踪标记的皮质脊髓束纤维和5羟色胺能神经纤维的免疫染色及其阳性面积统计结果说明有序胶原能与胶原靶向NT3形成体系,从而更有效的发挥修复脊髓损伤的作用；而且,这些再生的纤维与功能恢复具有一致性,暗示这些再生纤维对促进运动功能恢复的作用。结论：有序胶原支架和胶原靶向NT3能构成有机的体系,从而有效运载NT3,更有效的发挥NT3治疗脊髓损伤的作用。该治疗体系能更有效地促进运动功能的恢复和神经纤维的再生。总的神经丝、5羟色胺能神经纤维和顺行追踪剂标记的皮质脊髓束的再生与功能恢复有一致的关系。