环境毒物、高脂高糖等不良宫内环境，在胎儿基因序列不改变的情况下，可引起胚胎或胎儿表观基因组的改变，致使一些重要基因在成年期表达异常，影响成年后的健康状况。2，3，7，8-四氯苯并对二噁英(2，3，7，8-Tetrachlorobenzo-p-dioxin，TCDD)是二噁英中毒性最强的一种环境雌激素干扰物，主要来源于冶金及造纸业等工业生产、医院及城市垃圾的焚烧等，随被污染食物进入体内。　　卵泡发育(ovarian follicular development)是一个有序且复杂的过程，需要卵母细胞、颗粒细胞及卵泡膜细胞之间的双向交流。研究表明，卵母细胞分泌的转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β超家族的生长分化因子-9（growth and differentiation factor9，GDF9）和骨形态蛋白-15(bone morphogenetic protein15，BMP15或GDF9B)在卵泡发生的多个阶段，具有重要的作用。GDF9和/或BMP15表达或者功能异常，可能会导致卵巢卵泡发育异常，排卵异常致生育率降低，持续发情的发生率增加，类固醇激素水平异常，甚至卵巢早衰的发生。　　基于以上依据，我们提出课题的科学假设:宫内TCDD暴露致子代卵巢卵泡发育异常，可能与胚胎发育期表观基因组受到TCDD影响，成年期卵巢卵泡发育关键信号途径GDF9/Bmp15相关基因的表达水平改变有关。为了验证这一假设，本研究拟建立宫内低剂量TCDD暴露的大鼠传代模型（F1及F2代），观察分析宫内TCDD暴露是否影响F1及F2代大鼠的卵巢卵泡发育，并探讨GDF9/Bmp15在其中的作用及可能机制。　　第一部分:宫内TCDD暴露对子代大鼠卵巢卵泡发育和功能的影响　　目的:　　自胚胎发育7.25-7.5dpc时，原始生殖细胞(PGCs)依次向内胚层、生殖嵴迁移。在整个迁移过程中，PGCs迅速增殖，至13.5dpc时，形成生殖细胞簇，然后生殖细胞簇崩解形成原始卵泡，构成静止的原始卵泡储备池，在生命后期不可再生，一旦产生过少或者耗竭过快，会导致卵巢早衰。如果在此时期暴露于低剂量TCDD，则可能影响子代雌性大鼠成年期卵巢卵泡的发育。　　方法:　　在Sprague Dawley(SD)母鼠(F0)妊娠第8-14d(GD8-14)时，TCDD经口灌胃，剂量分别为100ng/kg·d和500ng/kg·d，玉米油+DMSO溶剂设为对照组。F0代大鼠分娩的仔鼠为F1代。从每窝F1代雌鼠中随机选取1只，于雌性仔鼠8周龄时与健康雄性大鼠合笼交配传代，F1代母鼠分娩的仔鼠为F2代。F1及F2代仔鼠出生21d(PND21)后分笼，开始观察每窝仔鼠和雌雄比例、雌性大鼠阴道开口日期，并在阴道开口后每天8:00和20:00进行两次阴道细胞涂片，观察动情周期情况，连续监测10个动情周期，大约45天左右。出生70d左右，在动情间期将大鼠处死，检测大鼠体重和卵巢重量、血清E2和FSH水平，HE染色连续切片计数各级卵泡数并观察卵巢病理改变，并采用TUNEL法检测卵泡细胞凋亡情况。　　结果:　　1.宫内TCDD暴露对F1及F2代窝仔数和雌雄比例无影响(P＞0.05)。　　2.与对照组相比，F1代100ng/kg TCDD组体重增加(p=0.014)，500ng/kgTCDD组卵巢重量减轻(p=0.028)，两TCDD处理组卵巢脏器比均降低（低剂量组:p=0.022;高剂量组:p=0.003）;F2代仔鼠的体重、卵巢重量及卵巢脏器比各组之间无统计学差异(P＞0.05)。　　3.仅F1代100ng/kg TCDD组仔鼠阴道开口时间略延迟(p=0.03)。在F1代，对照组大部分的仔鼠动情周期规律，其动情周期异常率为21％;100ng/kgTCDD组大约一半的仔鼠动情周期紊乱，而500ng/kg TCDD组75％的仔鼠动情周期紊乱。F2代对照组动情周期异常率为25％左右，低剂量及高剂量TCDD暴露组，其仔鼠动情周期异常率分别为45％和64％。　　4.F1代两TCDD染毒组血清E2水平明显低于对照组(100ng/kgTCDD:p=0.001;500ng/kg TCDD:p＜0.001)，血清FSH水平仅在500ng/kg TCDD组升高(p＜0.001);F2代仔鼠血清E2水平不受宫内TCDD暴露影响，同样血清FSH水平仅在500ng/kg TCDD组升高(p＜0.001)。　　5.F1及F2代TCDD处理组仔鼠卵巢的原始卵泡数均明显减少（F1代，100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001;F2代，100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001），而次级卵泡(F1代，100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001;F2代，100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)及黄体数等显著增加(F1代，100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001;F2代，100ng/kg:p=0.004;500ng/kg:p=0.001)，初级卵泡仅在F2代100ng/kgTCDD组升高(p=0.007)，闭锁卵泡各组之间无明显统计学差异(p＞0.05)。　　6.宫内TCDD暴露致F1及F2代仔鼠卵巢卵泡颗粒细胞凋亡明显增加(p＜0.05)，卵泡颗粒细胞凋亡率高于对照组10％以上，黄体卵泡细胞凋亡率在实验组与对照组之间有统计学差异(p＜0.05)。　　第二部分:宫内TCDD暴露对子代大鼠卵巢Gdf9和Bmp15表达的影响　　目的:　　本部分研究利用第一部分建立的大鼠模型，研究宫内TCDD暴露是否影响GDF9/Bmp15信号途径相关基因的mRNA及蛋白表达，探讨宫内TCDD暴露致子代成年大鼠卵巢卵泡发育异常的分子机制。　　方法:　　采用第一部分动物模型，用实时荧光定量PCR分析卵巢中基因Gdf9、Bmp15、Alk5、Alk6、Bmpr2的mRNA表达水平;采用Western blot检测GDF9和BMP15的蛋白表达水平。　　结果:　　1.在F1代，TCDD处理组卵巢中基因Gdf9（100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001）、Bmp15(100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)、Alk5(100ng/kg:p＜0.001;500ng/kg:p=0.024)、Alk6(100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)、Bmpr2(100ng/kg:p＜0.001;500ng/kg:p=0.006)的mRNA水平下调，然而在F2代，TCDD处理组卵巢中基因Gdf9(100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)、Bmp15(100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)、Alk5(100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)、Alk6(100ng/kg,500ng/kg:p＜0.001)、Bmpr2（100ng/kg:p＜0.001;500ng/kg:p=0.004）的mRNA水平上调。　　2.F1代中TCDD处理组GDF9(100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001)矛口BMP15(100ng/kg:p=0.006;500ng/kg:p=0.032)的蛋白表达水平下调，在F2代，TCDD处理组GDF9（100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001）和BMP15(100ng/kg，500ng/kg:p＜0.001)的蛋白水平上调。　　第三部分:宫内TCDD暴露对子代大鼠卵巢Gdf9和Bmp15甲基化的影响　　目的:　　本研究第二部分的结果表明，宫内TCDD暴露抑制F1代成年大鼠卵巢中GDF9/Bmp15信号途径相关基因mRNA和蛋白表达，却促进F2代成年大鼠卵巢该信号通路相关基因的mRNA和蛋白表达。那么，这种现象是否与表观遗传的DNA甲基化机制有关系呢？因此本部分实验拟对基因Gdf9和Bmp15的启动子区域进行DNA甲基化检测，探讨宫内TCDD暴露致子代成年雌性大鼠卵巢卵泡发育异常的表观调控机制。　　方法:　　采用亚硫酸氢钠修饰后测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)检测基因Gdf9和Bmp15启动子区域的甲基化情况。　　结果:　　F1及F2代仔鼠卵巢基因Gdf9和Bmp15启动子区域甲基化率在各组之间无差异。　　结论:　　1.宫内TCDD暴露可明显影响子代仔鼠的性激素分泌以及卵巢卵泡的发育，主要表现为抑制F1代E2分泌，促进高剂量组的F1及F2代大鼠的FSH分泌;扰乱其动情周期，致卵巢原始卵泡数减少，次级卵泡和排卵前卵泡及黄体数量等增加，促进卵泡细胞凋亡等。　　2.宫内TCDD暴露抑制F1代GDF9/Bmp15信号途径相关基因mRNA和蛋白表达，促进F2代GDF9/BMP15信号途径相关基因mRNA和蛋白表达。宫内TCDD暴露对卵巢卵泡发育的影响可能与DGF9/BMP15信号途径相关基因的异常表达有关系。　　3.宫内TCDD暴露没有影响F1及F2代基因Gdf9和Bmp15启动子区域的甲基化模式，推测GDF9和BMP15的异常表达不是由启动子区域DNA甲基化引起的，可能是由别的表观调控修饰方式如组蛋白修饰等来调控的。