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Forkhead蛋白为一种能通过转录调控来影响动物的胚胎发育、细胞增殖与分化、细胞凋亡以及免疫等过程的转录因子。近期完成的水螅核基因组测序项目结果显示,水螅也具有脊椎动物forkhead基因的同源基因。在高等动物中,forkhead蛋白是一种直接参与调控动物胚胎发育的重要转录因子,而水螅forkhead蛋白生理功能目前未知、值得深入研究。基于此,本研究围绕大乳头水螅forkhead基因进行了以下实验工作: 1.提取大乳头水螅总RNA,采用SMART技术制备大乳头水螅RACE cDNA文库,再以该文库为模板扩增了大乳头水螅forkhead基因cDNA序列,PCR产物纯化后与克隆载体pMD-18T连接,转化E.coli JM109菌株。运用菌落PCR方法鉴定阳性克隆后进行DNA测序,测序结果表明大乳头水螅forkhead基因cDNA序列编码区全长序列为963个核苷酸,编码321个氨基酸。大乳头水螅forkhead基因cDNA序列的成功克隆为深入探讨forkhead基因的分子进化及水螅forkhead蛋白的生理功能奠定了基础。 2.基于原核表达质粒pET-LT多酶切位点的特点设计引物,以已克隆获得的pMD18-T-forkhead重组质粒为模板,PCR扩增大乳头水螅forkhead基因片段(编码区cDNA序列的第7位点至963位点),再把该基因片段的PCR产物纯化后连接到原核表达质粒pET-LT上,构建重组表达载体pET-LT-forkhead,转化E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE胶检测结果表明本实验成功表达了重组水螅forkhead蛋白,并且该重组蛋白的主要存在形式为可溶性蛋白。本实验获得的重组水螅forkhead蛋白将有助于后续制备forkhead蛋白的抗体及利用分子免疫方法研究forkhead蛋白在水螅体内的表达模式和表达动态等科研工作的开展。