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目的:吗啡作为癌痛治疗的首选药物,具有不可替代性,然而多次用药产生的耐受现象严重阻碍了其临床应用,急需寻求一种延缓吗啡耐受的方法。同时目前已经表明疼痛的形成和调节机制具有性别二态性,这种性别二态性也已经成为疼痛领域研究的一个热点,为精准治疗提供了新的理论基础,具有强烈的现实意义。本文旨在探究小鼠吗啡耐受形成的性别差异及其机制,首先建立小鼠吗啡耐受模型,通过行为学方法检测Tlr2敲除和NPD1干预是否能够延缓小鼠吗啡耐受的形成并且是否存在性别差异。其次,在雄性小鼠和细胞模型中初步探讨了巨噬细胞胞外诱捕网与吗啡耐受形成的关系,为解释疼痛和吗啡镇痛的性别差异提供新的思路。方法:1.选取雄性和雌性C57BL/6小鼠,连续10天每天背部皮下注射吗啡10 mg/kg,以构建小鼠吗啡耐受模型。通过热板和甩尾实验进行行为学检测,探究吗啡镇痛作用是否存在性别差异。2.选取雄性和雌性Tlr2-/-小鼠,连续10天每天背部皮下注射吗啡10 mg/kg,探究Tlr2敲除后是否能够延缓小鼠吗啡耐受的形成并且是否存在性别差异。3.选取雄性和雌性C57BL/6小鼠,每天在给予吗啡处理之前30 min分别腹腔注射生理盐水或NPD1（2 ng、10ng、50ng）,探究NPD1是否能够延缓小鼠吗啡耐受的形成并且是否存在性别差异。4.通过q-PCR、WB、IF检测雄性WT小鼠吗啡耐受模型中巨噬细胞表面标记物F4/80和ETs标记物CitH3、PAD4在腰段DRG中的表达情况,探究METs是否参与雄性小鼠吗啡耐受的形成。在构建小鼠吗啡耐受模型前清除巨噬细胞,以探究吗啡耐受过程中ETs的形成是否与巨噬细胞密不可分。5.巨噬细胞RAW264.7 0、3、10、30、100 μM吗啡处理24h以模拟耐受状态,观察吗啡能否诱导其释放ETs。6.选取雄性C57BL/6小鼠,每天在给予吗啡处理之前30 min腹腔注射PAD4抑制剂Cl-amidine 10 mg/kg,探究抑制PAD4能否延缓雄性小鼠吗啡耐受的形成并检测胞外诱捕网相关分子的表达变化。7.通过q-PCR、WB、IF检测吗啡耐受模型中巨噬细胞表面标记物F4/80和ETs标记物CitH3、PAD4在腰段DRG中的表达情况,探究Tlr2敲除和NPD1干预可以延缓雄性小鼠吗啡耐受的形成是否同样与METs有关。结果:1.吗啡在短时间内能显著提高C57BL/6小鼠对热痛的反应潜伏期,然而随着给药次数增多会发展形成耐受,这在雌雄小鼠中均有发生。同时,雌雄小鼠热板和甩尾实验的基础痛阈存在明显差异,并且吗啡产生的镇痛效果也具有性别差异,在雄性小鼠中镇痛效果更显著。2.与WT小鼠相比,Tlr2-/-小鼠中吗啡的急性镇痛效果更显著,同时耐受发展也更缓慢,这种现象在雌雄小鼠中均类似。但是与Tlr2-/-雌性小鼠相比,Tlr2-/-雄性小鼠的基础痛阈更高,并且两者在吗啡的急性镇痛效果和耐受形成中均具有显著性差异,这些差异在甩尾实验中尤为明显。以上结果表明吗啡对Tlr2-/-小鼠的作用具有性别二态性。3.2 ng、10 ng、50 ng的NPD1均可以显著提高小鼠初次给药0-4 h内吗啡的镇痛效果并延缓耐受的形成,其中NPD1 2 ng组的镇痛作用最好。然而与雄性小鼠不同,在雌性小鼠中给予NPD1 2 ng并没有取得预期的效果,对于提高吗啡急性镇痛效果和延缓耐受的形成均没有统计学意义。此外,与雄性小鼠相比,同样给予NPD1 2 ng后雌性小鼠在甩尾实验中的反应潜伏期显著更低,表明NPD1缓解吗啡耐受形成的作用也具有性别差异。4.Q-PCR结果显示雄性WT小鼠DRG中Padi4的表达随着吗啡耐受的形成逐渐上调。同样,免疫荧光实验也观察到DRG组织中巨噬细胞表面标记物F4/80和ETs标记物CitH3存在共标。吗啡耐受小鼠的PAD4蛋白表达水平与对照组相比有明显上调,这与q-PCR结果一致,并且在清除巨噬细胞后,PAD4蛋白的表达水平与吗啡组相比显著下降。以上证据表明巨噬细胞和METs参与小鼠吗啡耐受的形成。5.RAW 264.7细胞贴壁后分别给予0、3、10、30、100 μM吗啡处理24 h,Western blotting结果显示ETs的两种标记物PAD4和CitH3在蛋白水平均有所上升,q-PCR也证实Padi4 mRNA表达水平的上升,在30μM剂量下达到峰值且具有显著的统计学差异。随后选取30 μM吗啡这个剂量进行细胞爬片实验,进一步证明了长时间吗啡处理可以诱导巨噬细胞释放ETs。6.行为学结果显示Cl-amidine单次给药对雄性小鼠热痛的反应潜伏期并没有太大的影响,但是重复给药可以显著延缓吗啡耐受的产生。Western blotting和q-PCR结果同样证明了与对照组相比,仅给予吗啡处理的小鼠PAD4的蛋白表达水平以及Padi4和F4/80的mRNA表达水平显著上升,但是在吗啡处理前给予Cl-amidine干预的小鼠与仅给予吗啡处理的小鼠相比,PAD4的蛋白表达水平显著下降,F4/80和Padi4的mRNA表达水平也显著下降。这表明Cl-amidine可以抑制雄性小鼠PAD4表达,从而减少巨噬细胞募集和ETs释放。此外在DRG组织的冰冻切片免疫荧光实验和相应细胞实验中也观察到了类似的结果。7.Tlr2敲除和NPD1干预都可以显著降低雄性吗啡耐受小鼠Padi4和F4/80的mRNA表达水平以及PAD4的蛋白表达水平。因此Tlr2敲除和NPD1干预可以延缓雄性小鼠吗啡耐受的形成同样与抑制巨噬细胞募集和ETs释放相关。结论:1.小鼠中吗啡产生的急性镇痛效果和耐受现象具有性别差异,而Tlr2敲除和NPD1干预能够延缓小鼠吗啡耐受的形成并且这种延缓作用存在性别差异。2.在雄性小鼠和细胞模型中证明巨噬细胞和胞外诱捕网参与吗啡耐受的形成,Cl-amidine、Tlr2敲除和NPD1可以延缓吗啡耐受的形成同样与抑制巨噬细胞募集和ETs释放相关。