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第一部分 丹参酮ⅡA磺酸钠对LPS诱导的小鼠肠损伤的保护作用目的:探讨丹参酮ⅡA磺酸钠(Tanshinone ⅡA sodium sulfonate,TSS)预处理对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠脓毒症肠损伤的保护作用。方法:实验1:6周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机表法分为2组:LPS 15只和TSS+LPS组15只。LPS组采用腹腔注射LPS 30mg/kg建立脓毒症小鼠模型;TSS+LPS组预先腹腔注射TSS 30mg/kg,0.5h后注射LPS 30mg/kg。每12小时观察小鼠死亡情况,观察小鼠LPS刺激后120h内的存活情况,绘制Kaplan-Meier生存曲线。实验2:6周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机表法分为3组:对照组(Control组)30只,LPS组30只和TSS+LPS组30只。正常对照组予以腹腔注射等体积生理盐水;LPS组采用腹腔注射LPS 30mg/kg建立脓毒症小鼠模型;TSS+LPS组预先腹腔注射TSS 30mg/kg,0.5h 后注射 LPS 30mg/kg。LPS 注射后 1h、6h、12h 分别处死小鼠,取空肠和回肠标本待检。HE染色评价空肠和回肠的病理损伤情况。结果:对照组空肠和回肠粘膜表层完整,绒毛排列整齐;LPS组小鼠空肠和回肠粘膜水肿,炎症细胞浸润,绒毛塌陷。对小肠绒毛的长度统计学分析显示,与对照组相比,LPS诱导1h、6h、12h时,空肠和回肠绒毛均明显缩短(P<0.05)。与LPS组相比,丹参酮ⅡA磺酸钠能够明显减轻不同时间点空肠和回肠绒毛水肿及炎症细胞浸润。与LPS组相比,在LPS刺激1h时,丹参酮ⅡA磺酸钠不能改善空肠和回肠绒毛的缩短情况,在LPS刺激6、12h时丹参酮ⅡA磺酸钠均能够明显抑制空肠和回肠绒毛的缩短(P<0.05),结果表明丹参酮ⅡA磺酸钠能够改善LPS诱导的小鼠空肠和回肠的肠道病理性损伤。与LPS组比较,丹参酮ⅡA磺酸钠预处理使小鼠48h生存率提高40%,而 120h 生存率提高 26.67%(P<0.05)。结论:LPS成功诱导小鼠空肠和回肠的急性损伤,丹参酮ⅡA磺酸钠能够明显减轻LPS刺激后空肠和回肠绒毛的水肿及炎症细胞浸润,并改善空肠和回肠绒毛缩短的情况,提高小鼠的生存率。第二部分 丹参酮ⅡA磺酸钠对LPS诱导的小鼠肠损伤炎症因子的影响目的:探讨丹生酮 ⅡA 磺酸钠(Tanshinone ⅡA sodium sulfonate,TSS)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠肠损伤的炎症因子的影响。方法:6周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机表法分为3组:对照组(Control组)30只,LPS组30只和TSS+LPS组30只。正常对照组予以腹腔注射等体积生理盐水;LPS组采用腹腔注射LPS 30mg/kg建立脓毒症小鼠模型;TSS+LPS组预先腹腔注射TSS 30mg/kg,0.5h后注射LPS 30mg/kg。LPS注射后1h、6h、12h处死小鼠,取空肠标本待检。采用酶联免疫吸附测定试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay kit,ELISA)和实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测空肠组织中促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;RT-PCR 检测抑炎因子白介素-10(interleukin-6,IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达。结果:与对照组相比,LPS明显上调了促炎症因子TNF-α、IL-β、IL-6的mRNA和蛋白水平的表达,并上调了抑炎因子IL-10和TGF-β的mRNA水平(P<0.05)。LPS刺激1h时TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β开始增加,并且在6h时出现明显的下降。与LPS组相比,丹生酮ⅡA磺酸钠在LPS刺激1h、6h、12h均能够明显下调TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA和蛋白水平,并上调IL-10和TGF-β的mRNA水平(P<0.05)。结论:丹生酮ⅡA磺酸钠能够抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和上调抑炎因子IL-10和TGF-β的表达水平,这可能是其改善LPS诱导的肠损伤的机制之一。第三部分 丹参酮ⅡA磺酸钠对LPS诱导的小鼠肠损伤自噬的影响目的:探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的肠上皮的自噬的变化趋势;并研究丹生酮ⅡA磺酸钠(Tanshinone ⅡA sodium sulfonate,TSS)对LPS诱导的小鼠肠损伤的自噬的影响。方法:6周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机表法分为3组:对照组(Control组)30只,LPS组30只和TSS+LPS组30只。正常对照组予以腹腔注射等体积生理盐水;LPS组采用腹腔注射LPS 30mg/kg建立脓毒症小鼠模型;TSS+LPS组预先腹腔注射TSS 30mg/kg,0.5h后注射LPS 30mg/kg。LPS注射后1h、6h、12h处死小鼠,取空肠标本待检。用RT-PCR法和免疫印迹法(Western blot法)检测空肠组织中自噬相关蛋白Microtubule-associated protein 1 light chain 3(MAP1-LC3,LC3)、Beclin-1 表达量的变化。透射电镜观察各组小鼠肠上皮细胞内的自噬体的变化,并统计自噬体的数量。结果:与对照组相比,当LPS刺激1h、6h、12h时,LPS下调了空肠上皮自噬标志蛋白Beclin-1和LC3的mRNA和蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.05)。与LPS组相比,在LPS刺激1h时TSS+LPS组空肠的自噬水平出现下降;然而在LPS刺激6h、12h时丹生酮ⅡA磺酸钠均能够明显上调Beclin-1和LC3的mRNA和蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.05)。透射电镜观察各组小鼠空肠上皮细胞内的自噬体的变化,结果显示:LPS组在各个时间点均未发现自噬体的典型结构,而TSS+LPS组在LPS刺激1h、6h、12h均能发现自噬体,与LPS组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:丹生酮ⅡA磺酸钠能够上调LPS诱导的肠损伤的自噬水平,这可能是丹生酮ⅡA磺酸钠改善LPS诱导的肠损伤的作用机制之一。