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乙型肝炎是一种常见的传染性疾病，据统计全世界有3.5亿慢性乙型肝炎病毒携带者。慢性乙肝患者发展成为肝硬化的风险比较高，这也是肝细胞癌和非肿瘤性的肝硬化并发症引起较高死亡率的主要原因。目前，治疗慢性乙型肝炎唯一持续有效的方法是系统的IFN-a治疗。但是只有1／3的慢性乙型肝炎患者能获得持续应答。核苷类似物如拉米夫定能使患者血清中的HBV DNA快速下降，也能使患者肝脏病理组织学得到改善。但是治疗停止后常常导致疾病很快复发，而且长期治疗也经常会使病毒发生选择性变异。针对这些情况我们有必要寻找一种新的治疗方法。虽然慢性乙型肝炎发病机制还没有完全被了解，但仍有一个共识，就是肝脏损伤是免疫介导的。具体的免疫治疗办法是尽可能替代使用干扰素或抗病毒药物，以加强治疗慢性乙型肝炎患者的疗效作用。甲基胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的某些侧序(CpG基序)最早是在细菌DNA内发现的，它对先天性和获得性免疫系统有不同的刺激作用。其中一些作用有助于增强Th1型佐剂抗原特异性反应的活性。例如，CpG DNA能促进95％B细胞的增殖，并分泌免疫球蛋白(Ig)和细胞因子，使B细胞得到保护，避免凋亡，所有这些有助于形成较强的体液反应。CpG DNA也可直接激活单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞分泌不同的Th1细胞因子，而这反过来又诱导T细胞和NK细胞分泌更多的细胞因子。总之，CpG诱导产生Th1型细胞因子，主要为白介素-12(IL-12的)和干扰素-g，很少分泌Th2型细胞因子，这些Th1型细胞因子可以使T细胞增强体液和细胞介导的免疫反应。在动物试验中，CpGODN已经被证明与各种抗原联合使用是有效的Th1型疫苗佐剂。例如，通过肌注免疫小鼠注射抗原和CpGODN会产生强烈的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和主要IgG2a抗体，也即Th1型反应。因为Th1型免疫反应被认为是清除乙肝病毒感染必要的反应，CpGODN与重组HBcAg很可能是一种有效的治疗性疫苗，用于治疗慢性乙型肝炎患者。因此，在我们的研究中，首先构建成功含HBcAg和CpG的重组真核表达质粒，肌肉注射重组质粒pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)免疫BALB／c小鼠，研究其对BALB／c小鼠的免疫作用。同时，将重组质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)转染人树突状细胞，研究转染后DC表面分子表达的变化和质粒对DC的免疫影响。此外，将转染DC后的培养上清诱导肝癌细胞株HepG2，研究HepG2的凋亡情况及其机制。最后，研究TLR9在不同病毒滴度的慢性乙肝、丙肝患者外周单个核细胞的表达情况。目的1．构建pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)和pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)基因真核表达载体，为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础。2．探讨重组质粒pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)对BALB／c小鼠免疫的作用。3．探讨重组质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)转染人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)后，对其表面分子的表达变化及免疫功能的影响。4．探讨重组质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)转染人外周血单核细胞来源树突状细胞后，细胞培养上清诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的作用及机制。5．研究TLR9受体在不同病毒载量慢性乙肝、丙肝患者的外周血单个核细胞(PMBC)中的表达。方法1．根据乙肝病毒核心抗原基因序列，设计合成三对引物，在引物中分别引入针对人、鼠敏感的CpG片段和不含CpG的片段，用PCR方法从慢性乙肝病人血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段，将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)和pEGFP-N1连接，构建重组体pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)和pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)，进行酶切、PCR及测序鉴定。2．构建真核表达质粒pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISSb，c)，将其免疫BALB／c小鼠，ELISA法检测免疫后小鼠血清中HBcAb、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4和IL-10的含量。3．构建真核表达质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISSa，c)，将其转染人外周血来源DC。用流式细胞仪检测转染的DC表面CD80和CD86的表达。用ELISA法检测转染后DC培养上清的IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10的水平。4．构建真核表达质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISSa，c)，将其转染人外周血来源DC，用培养上清诱导HepG2的凋亡。检测培养上清诱导HepG2凋亡的变化。5．检测慢性乙肝、丙肝患者血清病毒载量，并分析其与TLR9表达情况的关系。TLR9的蛋白表达水平用流式细胞术检测。研究组包括90名患者(60名慢性乙肝患者，30名慢性丙肝患者)和20名正常健康人作为对照。结果1．乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp。所构建的pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)和pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)重组体经双酶切及PCR鉴定，与预期片段的大小相符；测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致，表明pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)和pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确。2．pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISSb，c)重组质粒均能诱导BALB／c小鼠产生特异性抗体HBcAb，pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISSb)组较pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISSc)组产生的抗-HBc效价显著增高(P＜0.01)，且其免疫BALB／c小鼠后能使Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-12的表达增强，抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-10的产生。3．pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISSa)转染的DC表面CD80和CD86的表达均有明显升高(P＜0.01)。转染后上清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-12的表达增强(P＜0.01)，Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达下降(P＜0.05)。4．pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISSa)组培养上清对HepG2细胞具有促凋亡作用，随着培养时间延长，细胞凋亡率逐渐增加[0h：(2.8±0.8)％，6h：(7.6±1.0)％，12h：(9.2±1.1)％，18h：(12.6±1.2)％，24h：(17.7±0.7)％，P＜0.05]。5．结果显示与正常对照组比较乙肝、丙肝病毒慢性感染导致TLR9蛋白表达水平减少(P＜0.05)。TLR9蛋白表达水平与慢性乙肝血清病毒载量和慢性丙肝血清病毒载量呈负相关(r=-0.632，r=-0.909，P＜0.01)。结论1．成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISS)和pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISS)，为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础。2．pZeoSV2(+)／CpG-HBcAg(ISSb，c)重组质粒对小鼠HBcAb的产生具有明显的促进作用，含CpG-HBcAg(ISSb)的重组质粒能够明显增强Th1型细胞因子的表达，抑制Th2型细胞因子的表达。3．重组质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISSa)转染可提高DC表面共刺激分子的表达，且能够明显诱导Th1型细胞因子(IFN-γ和IL-12)的产生，抑制Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)的产生。4．重组质粒pEGFP-N1／CpG-HBcAg(ISSa)转染培养上清能明显促进肝癌细胞株HepG2的凋亡。5．慢性乙肝、丙肝患者PMBC的TLR9蛋白表达水平降低，且与血清病毒载量呈负相关关系，具有检测病毒复制情况的作用。