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背景与目的: 射频消融治疗(radiofrequency ablation,RFA)已成为无法切除的中晚期肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)主要的局部治疗方法。相关研究发现RFA消融不足(残余灶)的HCC细胞发生上皮间质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)促进HCC侵袭转移。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,LncRNAs)可在多种层面上调控基因的表达水平。然而,EMT相关LncRNAs在残余灶加速进展中的作用不清楚。 材料与方法: 1、体外模拟HCCRFA低温区残余灶细胞模型的建立及分析EMT表型及生物学行为:采用47℃热诱导Huh7细胞获得Huh7-H细胞模拟HCC RFA低温区残余灶细胞。蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测EMT表型标记的表达。CCK-8检测细胞增殖能力和Transwell检测细胞迁移与侵袭能力。 2、LncRNAs筛选:采用LncPathTM Human EMT Array分析EMT相关通路LncRNAs。qRT-PCR检测高转移肝癌细胞系和低转移肝癌细胞系的LncRNA FUNDC2P4表达情况。临床检测肝癌组织、癌旁组织及RFA术后残余组织LncRNA FUNDC2P4表达情况。 3、LncRNA FUNDC2P4功能及机制分析:GV367-FUNDC2P4、FUNDC2P4-siRNA分别转染SMMC-7721、Huh7。CCK-8实验及Transwell、划痕实验检测细胞增殖、迁移和侵袭功能。WB检测EMT分子标记初步探讨作用机制。 结果: 1、Huh7-H细胞系的建立与鉴定 镜下显示Huh7-H呈EMT特征性改变。WB检测显示Huh7-H细胞上E-cadherin表达降低,N-cadherin、vimentin表达增加。CCK-8增殖实验显示Huh7-H增殖能力显著增强。Transwell迁移实验显示Huh7-H细胞迁移和侵袭能力均明显增强。 2、LncRNA FUNDC2P4在Huh7-H细胞和HCC RFA残余灶表达下调 采用LncPathTM Human EMT Array芯片获得Huh7-H、Huh7基因表达数据,聚类分析Huh7-H、Huh7差异表达的LncRNA。筛选出3个差异表达LncRNA,即2条LncRNAs下调:FUNDC2P4(ENST00000441207)、RPL27P7(ENST00000441321),1条LncRNA:MTND4LP14(ENST00000429447)。qRT-PCR检测证实,Huh7-H组FUNDC2P4、RPL27P7、MTND4LP14基因表达丰度分别是Huh7组的0.137、0.869、1.037倍。qRT-PCR检测显示LncRNAFUNDC2P4在高转移肝癌细胞系SMMC-7721和HCCLM3表达显著低于低转移肝癌细胞系Huh7和Hep3B。qRT-PCR检测显示LncRNA FUNDC2P4在癌旁组织表达高于HCC组织,HCC组织高于RFA术后残余HCC组织。 3、LncRNA FUNDC2P4抑制HCC细胞增殖,迁移和侵袭 采用LV-FUNDC2P4转染SMMC-7721细胞建立过表达FUNDC2P4的HCC细胞系。CCK-8增殖实验显示LV-FUNDC2P4组增殖能力显著减弱。Transwell实验和划痕实验显示LV-FUNDC2P4组迁移和侵袭能力均明显减弱。采用siRNA技术敲除Huh7细胞中的FUNDC2P4,用FUNDC2P4-siRNA-121转染Huh7,建立稳定沉默FUNDC2P4的HCC细胞系。CCK-8增殖实验显示FUNDC2P4-siRNA-121组增殖能力显著增强。Transwell实验和划痕实验显示FUNDC2P4-siRNA-121组迁移和侵袭能力均明显增强。 4、LncRNA FUNDC2P4通过调控E-cadherin的表达参与EMT WB检测显示LV-FUNDC2P4转染SMMC-7721细胞中E-cadherin的表达显著上调,FUNDC2P4-siRNA-121转染Huh7细胞E-cadherin的表达水平显著下降。然而N-cadherin和Vimentin表达均无统计学差异。 结论: 1、采用47℃水浴加热Huh7细胞诱导Huh7-H细胞成功模拟HCC RFA低温区残余灶细胞。 2、采用LncPathTM Human EMT Array成功筛选出LncRNA FUNDC2P4。细胞及组织病理证实LncRNA FUNDC2P4表达与HCC恶性程度及进展负相关。 3、LncRNA FUNDC2P4可能通过调控E-cadherin参与EMT,从而抑制HCC细胞增殖,迁移和侵袭。