龙胆是一味传统中药,具有泻肝胆实火功效。目前,龙胆药材质量评价物质基础是以单一龙胆苦苷为指标的含量测定,暂不能体现中药龙胆的整体质量,严重阻碍了龙胆药材质量的有效控制。其次,龙胆生物活性和保肝利胆的作用机制研究不够深入。目的:本研究从龙胆关键药效组分的物质基础、保肝利胆作用机制研究入手开展研究,筛选龙胆保肝利胆作用的关键药效组分,揭示龙胆关键药效组分化学组成,为明确龙胆质量标志物和构建科学合理的质量标准奠定基础;并基于细胞和动物水平对酒精和非酒精性肝损伤模型进行深入研究,阐明龙胆关键药效组分的保肝利胆作用机制,为龙胆药材的资源利用和临床研究提供科学基础;同时,构建肠道微生物群与血液代谢相关性的图谱,为龙胆关键药效组分的开发应用提供理论依据。方法:1.为初步明确龙胆质量评价的质量标志物,对龙胆关键药效组分进行科学研究。首先,利用工艺优化后的大孔树脂柱分离技术获得龙胆组分群;结合得率,有效成分含量和细胞活性等,确定龙胆关键药效组分。其次,通过液-质联用（LC-Q-TOF-MS）技术对龙胆关键药效组分的化学成分进行分析,明确龙胆关键药效组分的化学组成。2.探索龙胆关键药效组分在细胞水平的活性及机制。分别以脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型和游离脂肪酸（FFA）诱导的肝癌细胞（Hep G2）为脂肪肝模型,采用CCK-8法,分别考察在0～8.0 mg·m L-1浓度范围内对细胞存活率的影响,以肝功能丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平和炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平,油红O染色法和TG含量为考察指标,评价龙胆关键药效组分的抗炎、保肝、降脂活性。采用荧光定量PCR法（q PCR）测定细胞Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-kappa B（NF-κB）m RNA水平;蛋白印迹法（Western Blot）测定NF-κB、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）和核因子κB抑制因子α（IκBα）蛋白的表达,寻找细胞水平抗炎、降脂以及保肝活性的分子机制。3.揭示龙胆关键药效组分在小鼠模型上的保肝作用及机制。（1）利用酒精诱导小鼠酒精性肝损伤模型,通过苏木精—伊红染色法（HE染色法）、微板法、酶联免疫法（Elisa法）、PCR法和Western blot法等检测方法,评价血清和肝脏组织中的酶活性及基因和蛋白的表达水平,明确在TLR4/NF-κB和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）信号通路中龙胆关键药效组分的药效作用,探索龙胆组分对酒精性肝损伤保护作用中的潜在机制。（2）利用高脂饲料诱导的小鼠脂肪肝模型,采用HE染色法、油红O染色法、微板法、Elisa法等测定脂质代谢相关指标;使用PCR法和Western blot法检测肝脏相关基因和蛋白的表达水平,基于TLR4/NF-κB、固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）/乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）/脂肪酸合成酶（FAS）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）/肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信号通路探索龙胆关键药效组分对非酒精性肝损伤中的保护作用及潜在机制。4.阐明龙胆关键药效组分保肝同时利胆作用机理。利用小鼠酒精性和非酒精性肝胆损伤模型,通过体式显微镜观察胆囊形态变化,以微板法、Elisa法检测胆汁及血清指标碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转移酶（GGT）、总胆红素（TBIL）、胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）的含量,同时采用PCR法和Western blot法测定Farnesoid X受体（FXR）、成纤维细胞生长因子受体-4（FGFR4）、胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）等的m RNA和蛋白表达,揭示基于FXR/FGFR4/CYP7A1信号通路保肝利胆作用机制。5.利用LC-MS和16S r DNA高通量测序技术,筛选代谢差异物并分析肠道菌群组成,探索龙胆关键药效组分对非酒精性脂肪肝代谢与肠道菌群调控的影响。结果:1.对龙胆药材进行提取、分离和鉴定发现,通过大孔树脂柱分离的30%乙醇洗脱液得率适中,质量评价指标龙胆苦苷含量与其他浓度乙醇洗脱液相比最高,且经过细胞活性筛选,具有最佳的保肝、抗炎、降脂活性,因此,明确30%乙醇洗脱液为龙胆关键药效组分。LC-Q-TOF-MS法分析了龙胆关键药效组分的化学组成,共鉴定出63种化合物,正离子和负离子分别鉴定出17种和46种化合物。并且经过对大孔吸附树脂各种影响因素的筛选,优化了分离纯化工艺,制备了龙胆关键药效组分,该制备工艺简单、稳定、可行,为后续的药效学研究提供了物质保障,为工业化的生产提供了理论指导。2.细胞活性筛选发现,以LPS诱导的RAW264.7细胞为炎症模型中,成功构建经典炎症模型,经过龙胆关键药效组分治疗后,炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量提示龙胆关键药效组分具有抗炎活性。以FFA诱导的Hep G2细胞为脂肪肝模型中,通过CCK-8筛选出最佳FFA造模浓度为0.5 m M,最优的龙胆关键药效组分浓度为0.5-2.0 g·m L-1;经过龙胆关键药效组分治疗后,油红O染色和TG含量结果提示龙胆关键药效组分具有明显降脂活性;通过测定炎症因子水平表明龙胆关键药效组分具有显著抗炎活性。3.利用乙醇诱导的小鼠酒精性肝损伤模型中,酒精模型组小鼠血清内ALT、AST、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著高于正常组（P＜0.05）,龙胆关键药效组分组与酒精模型组相比数值均有不同程度的下降（P＜0.05）;肝脏病理学观察结果显示,酒精模型组肝索排列紊乱且肝细胞出现炎性因子浸润和脂肪空泡,龙胆关键药效组分干预后炎症因子浸润状况均有减轻;与正常组相比,酒精模型组小鼠肝脏组织TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65和p38MAPK蛋白的表达水平有不同程度的升高（P＜0.05）,龙胆关键药效组分干预后均有不同程度的降低（P＜0.05）。利用高脂饲料诱导的小鼠脂肪肝模型中,采用HE染色法和油红O染色法发现,与正常组相比,高脂饲料喂养后出现大量炎性浸润和脂滴的积累,龙胆关键药效组分治疗后得到显著改善。与模型组比较,龙胆关键药效组分治疗后,TG含量,AST、ALT、IL-1β、IL-6和TNF-α水平,TLR4、NF-κB、SREBP-1c和FAS等m RNA表达水平均显著降低（P＜0.05）;TLR4、NF-κB、SREBP-1c、ACC1、FAS、PPARα、AMPK和p-NF-κB等蛋白水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,CPT-1和IκBα蛋白表达均显著升高（P＜0.01）。4.利用小鼠酒精性和非酒精性肝胆损伤模型,通过体式显微镜观察胆囊形态变化发现,与正常组相比,模型组小鼠胆囊内胆汁呈褐色浑浊状态,肉眼可见絮状沉淀,龙胆关键药效组分给药后小鼠胆汁浑浊程度明显降低、其中高剂量给药组小鼠胆囊内更为澄澈。与正常组相比,模型组小鼠血清中ALP、GGT和TBIL水平均显著升高（P＜0.05）;胆汁内TC含量显著增多（P＜0.01）,TBA含量显著减少（P＜0.01）;肝脏FXR和FGFR4的m RNA和蛋白表达量均明显增多（P＜0.05）,CYP7A1的m RNA表达显著降低（P＜0.05）、蛋白表达量呈明显降低趋,而龙胆关键药效组分给药后这些指标均有所改善。5.利用LC-MS血清非靶向代谢组学和16S r DNA高通量测序技术研究龙胆关键药效组分对NAFLD的影响,代谢组学分析发现,龙胆关键药效组分治疗后显著改变了氨基酸、Gentiopicroside以及Cinnoline、Galabiosylceramide、Tryptophyl-Tyrosine等代谢物的水平,而这些代谢物参与了调节胆汁分泌、色氨酸代谢和脂质代谢等体内代谢途径。肠道细菌分析发现,龙胆关键药效组分改变了肠道细菌的群落组成结构,其特点是有益菌增加,有害菌减少。此外,相关分析表明,龙胆关键药效组分对代谢物的影响与肠道菌群Bacteroides,Lactobacillus,Muribaculum,Prevotellaceae＿UCG＿001为正相关。最后,联合分析发现,代谢物与Firmicutes和Actinobacteriota菌属的调节相关,并且与脂质水平呈正相关。结论:课题基于龙胆得率、质控成分龙胆苦苷的含量及保肝抗炎活性强度,明确了龙胆关键药效组分。基于细胞水平的活性及作用机制研究表明,龙胆关键药效组分具有良好的保肝作用,通过抑制脂质积累、抗炎、抑制脂肪酸氧化等起到保肝作用,具体机制与激活TLR4/NF-κB、SREBP-1c/ACC1/FAS、PPARα/CPT-1和AMPK信号通路有关。同时,龙胆关键药效组分也具有良好的利胆作用,与调控胆固醇-胆汁酸代谢通路的关键因子FXR、FGFR4、CYP7A1的m RNA和蛋白表达水平有关。代谢组学和肠道菌群联合分析表明,龙胆关键药效组分可改善模型动物肠道菌群、脂质代谢和胆汁酸代谢,构建了肠道微生物群与血液代谢相关性的图谱,揭示了关键肠道微生物代谢物组合,为进一步研究NAFLD的疾病机制奠定了基础。该研究为治疗肝胆损伤病提供了理论和科学基础,为探索龙胆质量标志物及建立完善的质量评价标准提供了新思路,同时为龙胆关键药效组分的开发应用及药用资源开发提供依据。