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高尿酸血症是指人体血尿酸水平长期处于过饱和状态所引起的一系列症状总称,是诱发系列健康问题重要因素之一。目前常用的降尿酸药物(如别嘌呤醇)由于具有显著依赖性与毒副作用,使得天然安全高效的降尿酸肽的研究和开发日趋升温。前期实验研究发现金枪鱼蛋白水解物(TPH)可显著抑制高尿酸血症大鼠血清中黄嘌呤氧化酶(XO)活性,从而降低其血尿酸水平。本文旨在明晰TPH中黄嘌呤氧化酶抑制肽构效关系及XO抑制作用机制。首先通过对比不同缓冲试剂对TPH体外XO抑制活性的影响,获得最优体外XO抑制率检测模型,结合多种分离手段从TPH中富集强XO抑制活性组分,并通过质谱联用技术鉴定其氨基酸序列;采用固相合成法获得目标XO抑制肽,综合XO抑制活性及其残基与XO相互作用特点,分析XO抑制肽的构效关系及其XO抑制作用分子机制,为XO抑制肽研究与降尿酸肽产品开发提供理论和方法的参考。(1)针对目前未考虑不同缓冲体系中离子类型及强度对多肽和酶构象的影响,而直接参考其它小分子抑制剂活性测定方法来测定多肽XO抑制率的问题。本论文对比探究了三种常用缓冲试剂对多肽XO抑制率测定结果的影响。结果表明TPH在三种缓冲液中未见明显结构变化,但缓冲液HEPES与XO和TPH会产生相互作用,降低XO的α-螺旋含量,使得酶结构更加松弛,从而导致TPH在HEPES体系中具有更高的XO抑制率,为评价缓冲试剂对体外天然大分子生物活性的影响研究提供了参考。(2)采用乙醇溶液和Sephadex G-15对TPH中XO抑制多肽进行高效分离。结果发现醇溶组分(ESF)的XO抑制活性最好,这可能与其中含有更多疏水性氨基酸残基和<1 kDa的肽密切相关;采用体外XO抑制率为筛选指标,从Sphadex G-15 8个分离组分中确认P6组分活性最佳;并通过UPLC-Q-TOF-MS/MS从中鉴定出13条肽,其中FH的XO抑制活性最佳。同时对比本研究HPLC法和文献中使用的UV方法测定13条肽的XO抑制活性,发现UV法并不适用于测定包含Trp的肽。(3)利用分子对接方法探究了本研究鉴定的XO抑制肽与XO相互作用模式。首先归纳了已知抑制剂配体与XO的作用特点。通过XO抑制肽FH的抑制作用机制研究发现,FH可与底物竞争XO活性中心位点,并与XO活性中心Phe-914、Ser-876及Thr-1010残基之间存在相互作用,从而起到抑制XO活性作用。此外,Phe对肽的XO抑制活性至关重要,且碱性氨基酸能增强含Phe残基寡肽的XO抑制活性。