目的： 2型糖尿病（ type 2 diabetes mellitus, T2DM）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）中最常见的一种形式，是以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减弱为特征的遗传异质性疾病，其机制尚未完全清楚。人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)系统是目前已知的最为复杂的抗原系统之一，它携有人类遗传信息约1‰，具有显著的多态性，该系统的一些基因也是参与某些疾病易感性的重要基因之一。以往研究发现许多有遗传倾向疾病的发生与HLA有关。T2DM遗传性强，对其与HLA的关联研究是该疾病中必不可少的一项内容。随着分子生物学分型技术的出现，尤其是聚合酶链式反应（PCR）的问世，出现了许多如PCR-RFLP、PCR-SSO和PCR-SSP等先进的基因分型方法，对HLA-Ⅱ类基因 与T2DM 关联研究也日趋增多。90年代初，Rich等发现T2DM 与HLA-DR4存在着某些关联，此后又发现HLA-DR基因在家族史中患T2DM 的父代对患1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）子代传递中有明显改变，DR4很可能是T1DM 和T2DM共同的遗传基础，后来国内吴松华等也报道常见型T2DM与HLA-DQA1基因有关联，国外学者Tuomi和Fukui 等分别研究了T2DM患者中谷氨酸脱羧酶抗体阳性对HLA分布的影响。但是，对T2DM家系中T2DM与<WP=4>HLA-DRB1*和DQB1*基因的关联研究，特别是对决定该病易感性的是这些基因本身还是与其在同一单倍型上的其它位点基因或者是它们共同作用的研究，至今尚未见报道。我们随机选择唐山地区汉族6个具有T2DM家族史的家系，进行HLA-DRB1*和DQB1*基因单倍型分析，旨在探讨HLA-DRB1*和DQB1*基因单倍型与该病的关联。方法： 1 基因组DNA的提取：选择符合条件的T2DM家系6个，其中患者22名，分别抽取2%EDTA抗凝的静脉血5ml ，低渗裂解红细胞，收集白细胞，用蛋白酶K消化处理和饱和酚/氯仿提取基因组DNA，测OD值，调整DNA浓度至50-100ng/μl。2 聚合酶链反应（PCR）体外基因扩增：采用ELPHA HLA-DRB和HLA-DQB低分辨率分型方法，试剂盒及DRB1*基因和DQB1*基因引物由德国Biotest公司提供，扩增仪为美国PE-9600，检测HLA-DRB1*等位基因 的PCR反应体系100μl 含有60.5μl H2O、10.0μl 10×PCR buffer、 16.0μldNTP(2mM)、 8.0μl Primer Mix C、 0.5μl Taq(5U/μl)及 5μl DNA(50ng/μl)。扩增产物为一条277bp带，如样品有DR2，则同时出现一条339bp带。检测HLA-DQB1*等位基因的PCR反应体系50μl含有32.5μl H2O、5.0μl 10×PCR buffer、8.0μldNTP(2mM)、2.0μl Primer MixA或B、0.5μl Taq(5U/μl)及2μl DNA(50ng/μl)。A扩增产物为一条246bp的产物，B扩增产物为一条231bp的产物。在没有特异性PCR产物的PCR样本中可看到422bp内对照。扩增条件均为：95℃预变性5min，然后于95℃15sec、55℃15sec、72℃15sec为<WP=5>一个循环进行扩增，共30个循环，结束后于72℃延伸6min。3 基因型确定：采用酶联探针杂交分析（ELPHA）)方法，Biotest ELPHA HLA-DRB和HLA-DQB低分辨率分型试剂盒分别包括分析DRB基因型的24个位点序列特异性寡核苷酸（SSO）探针和分析DQB基因型的23个位点SSO探针，分别包被在微孔中，根据其检测程序，按板条编号1、2、3，每个样品使用3条，在2 ml离心管中加入相对应的扩增PCR产物，加变性液后使双链PCR产物变性为单链DNA分子，再加入一定量的中和液和水，将稀释后的PCR产物用多道加样枪加到微孔板条孔中进行杂交，洗去与PCR产物未杂交的探针，加入抗体交联剂及显色剂，用酶标仪于450nm处测OD值，然后根据所提供杂交反应格局图判断各样本的DRB、DQB等位基因型。4 单倍型分离分析：若疾病与HLA-DRB1*、DQB1*无关，在一家庭中，亲代的两个单倍型将在子代中呈随机分布，反之成非随机分布。按公式χ2=(|∑F-∑f|-0.5)/∑V(f)计算HLA-DRB1*-DQB1*单倍型在家庭中的分布，确定本病与HLA-DRB1*-DQB1*单倍型是否关联。5 患病同胞共享HLA-DRB1*-DQB1*单倍型分析：根据分离率，正常家庭同胞中共享HLA单倍型的分布按两条单倍型相同，一条单倍型相同, 两条单倍型不同三种类型的比例，期望值分别为25%、50%、25%；与疾病呈显性相关的单倍型分布的期望值为50%、50%、0%；呈隐性相关的期望值为100%、0%、0%。根据以上模式计算T2DM<WP=6>患者同胞间共享HLA-DRB1*-DQB1*单倍型的偏离情况。6 Lods分析：本文6个家系均满足其分析条件，婚配类型为GgTt×ggtt和GgTt×GgTt。判断标准：Lods值＞1支持连锁，Lods值＞3肯定连锁，Lods值＜-2否定连锁。两基因位点的重组率（θ）≤0.10位紧密连锁，θ≥0.20为松弛连锁，0.10＜θ＜0.20为中度连锁。结果：1 单倍型分离分析：单倍型分离分析结果表明T2DM家系中的HLA-DRB1*-DQB1*单倍型呈随机分布，与随机分布未发生显著偏离（χ2=0.94，df=1，P＞0.25），本病可能与HLA-DRB1*-DQB1*单倍型无关联。 2 患病同胞共享单倍型分析：在对6个家庭15例子一代患病同胞作共享单倍型分析时，患病同胞共享HLA-DRB1*-DQB1*单倍型频率的观察值与期望值相比无明显增高（∑χ2=3.94，df=2，P＞0.1），说明HLA-DRB1*-DQB1*单倍型与随机分布未发生显著偏离。3 Lods分析：6