论文部分内容阅读
溶瘤病毒除了将肿瘤细胞直接裂解外,宿主对病毒的免疫反应而带来的疗效也至关重要,研究表明自然杀伤细胞(NK)和T细胞的浸润与预后的改善有相关性。肿瘤内给药的溶瘤病毒可吸引免疫细胞,使病灶中的肿瘤微环境向利好方向发展并增加CD8+T细胞的浸润,目前大多数免疫疗法方案都集中在增强T细胞免疫反应上,但是最近对利用NK细胞进行治疗和干预肿瘤进程产生了浓厚的兴趣。NK细胞作为免疫细胞的一种,其表达各种活化和抑制种系编码受体,因此能够直接靶向并杀死外源细胞,而无需MHC特异性,在肿瘤进程下增强NK细胞的功能是免疫疗法中令人期待的途径,其旨在启动多层免疫反应,达到高水平治疗效果。检查点抑制剂是目前有效的治疗癌症的方法之一。使用治疗性单克隆抗体(m Ab)可以阻断免疫抑制的“检查点”受体,从而在控制肿瘤进程方面取得了空前的进步。通过阻断效应淋巴细胞的抑制途径,来增强这些免疫细胞的抗肿瘤活性。同时进一步将抑制信号的阻断与激活信号的传递结合起来,可以提高免疫疗法的功效。在许多人类癌症中,NKG2A受体在肿瘤床中的NK和T细胞上表达,并且研究还发现其配体HLA-E在肿瘤中经常过表达。一项研究显示,在几种肿瘤小鼠模型中,NKG2A的表达与较差的临床结果有关。因此,用阻断性抗体靶向NKG2A具有增强NK细胞免疫反应的独特优势。本文用紫外线灭活的2型溶瘤单纯疱疹病毒(UVoHSV2)刺激NK细胞,研究NK细胞诱导的抗肿瘤作用及其机制。另外,在体外和体内研究了针对检查点(NKG2A)的抗体治疗并联合UV-o HSV2刺激对NK细胞抗肿瘤活性的影响。团队前期的研究表明UVoHSV2激活的淋巴细胞在鼠结肠癌模型(CT26模型)及鼠乳腺癌模型(4T1模型)上有较好的治疗效果,其中CT26模型肿瘤消失。本文进一步研究了人源NK细胞对BGC823(人胃癌细胞)肿瘤细胞的体外杀伤效果,UVoHSV2刺激NK细胞释放IFN-γ帮助杀伤肿瘤细胞,同时为了更近一步研究NK细胞的免疫抗肿瘤进程,选用了NK92细胞作为模型。NK92作为激活状态的NK细胞模型,对BGC823存在杀伤效果(E:T=5:1,44.76±1.84)且UVoHSV2刺激后的NK92细胞针对BGC823及A549的杀伤效果有显著的增强(E:T=5:1,69.64±1.29),与NK细胞相似的UVoHSV2刺激后的NK92细胞IFN-γ的释放量(223.86±4.15pg/ml)增加。体外获得了TLR2蛋白的基因全长构建了表达TLR2的质粒载体,电转染NK92细胞使其TLR2蛋白过表达并且使用Anti-TLR2抗体封闭TLR2蛋白,验证了UVoHSV2通过TLR2蛋白激活了NK92细胞,增强了IFN-γ的释放并且进一步的增强了NK92细胞对BGC823肿瘤细胞的杀伤。利用Western blot方法验证了TLR2蛋白能够诱导NK92细胞p65磷酸化的水平的升高,当使用针对NF-κB的抑制剂BYA 11-7082阻断NK92细胞的NF-κB信号通路后磷酸化的水平减弱,同时BYA11-7082也使得最终IFN-γ的释放量从(573.52±4.38 pg/ml)降低至(263.87±6.48pg/ml),说明UVoHSV2通过TLR2蛋白激活NF-κB信号通路。同时我们发现UVoHSV2可以增加NK细胞上NKG2A的表达,Anti-NKG2A抗体封闭NKG2A蛋白功能后,NK细胞和NK92细胞体外杀伤BGC823细胞的能力增强,其中Anti-NKG2A抗体封闭后UVoHSV2刺激NK92组中杀伤率从(54.36±1.93)提升到(68.07±1.32),同时使用BGC823细胞植瘤,建立裸鼠肿瘤模型,Anti-NKG2A抗体孵育增强了UVoHSV2刺激的NK92细胞的抗肿瘤活性。结果显示:UVoHSV2可以有效激活NK细胞增强其体外抗肿瘤活性,并通过Toll样受体2(TLR2)/NF-κB信号传导途径释放IFN-γ。进一步的UVoHSV2刺激上调了检查点分子NKG2A,Anti-NKG2A抗体处理可进一步增强UVoHSV2刺激的NK92细胞的体外和体内抗肿瘤作用。