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蛋白酶作为工业三大用酶之一,同时也是用途最广泛的酶制剂之一,其在世界酶类销售总额中占据了60%,在食品、医药、洗涤剂、化妆品、纺织、制革、保健品以及废物处理等行业都有着很好的应用前景。通过宏基因组技术,已经从矿坑/堆肥土、泥土、戈壁/沙漠等环境中分别筛选到了具有新型结构域的金属蛋白酶、可分解纤维蛋白的金属蛋白酶、新型丝氨酸蛋白酶等；丰富了蛋白酶的种类,为蛋白酶的工业应用提供了资源。但是目前通过宏基因组技术筛选到的蛋白酶只适合于理论基础研究,不能应用于工业生产。酯类水解酶(包括酯酶和脂肪酶)能稳定存在于有机溶剂中,其催化的反应具有高立体选择性、高区域选择性、不需要辅因子、不发生副反应等,这使得酯酶和脂肪酶广泛应用于工业、制药和食品等领域。已从土壤、淡水、热液口、表层和深层海底沉积物等多种环境中筛选到酯类水解酶,但大多数不具备工业应用价值。因此,需要继续开展宏基因组研究以获取具有更高工业价值的蛋白酶、酯类水解酶。一、通过构建宏基因组文库筛选北极、大西洋海底表层沉积物样品中的蛋白酶、酯类水解酶基因构建了北极黄河站王湾stn.3位点海底表层沉积物fosmid宏基因组文库,文库容量为2700,包含的环境基因组DNA约为94.5Mbp。对ST3宏基因组文库进行功能筛选,获得了2个蛋白酶阳性克隆(12-3C、21-5G)。Fosmid中表达蛋白酶的基因序列比对分析结果显示,蛋白酶3C从属于M4_uncharacterized家族；蛋白酶5G从属于M10A/M12A家族；在NCBInr数据库中与它们相似的基本都是基因组预测蛋白和假想蛋白。利用大西洋26II-NAR-S009-TVG05/07两个位点的深海表层沉积物样品,构建了一个库容量约为17000的fosmid宏基因组文库,该文库包含的环境基因组DNA约为595Mbp。通过功能筛选,得到了3个携带酯类水解酶基因的fosmid克隆和5个可表达蛋白酶的fosmid克隆。二、蛋白酶3C的序列分析、异源表达及酶学性质研究对蛋白酶3C的序列进行比对分析,与3C序列最相似的序列来源于Janthinobacterium lividum的基因组假想蛋白,从属于M4_uncharacterized家族,相似性为51%；在NCBInr数据库中与3C相似的大部分为来自微生物菌株基因组中的假想蛋白和预测蛋白。通过功能筛选获得的蛋白酶,可以就其理化性质进行研究,不但能够丰富该家族蛋白酶序列的多样性,而且能够了解该家族蛋白酶理化性质特点和应用潜力。随后,在Escherichia coli BL21(DE3)中,对蛋白酶进行了异源表达和分离纯化。对收集的菌体超声破碎,镍亲和层析,纯化到的蛋白酶是酶原形式,没有活性。M4_uncharacterized家族同源于M4家族,也被称作为thermolysin-like peptidase (TLP)家族,这个家族一般包含一个信号肽、一个前导肽和一个肽酶单元三个结构域。信号肽辅助蛋白酶3C穿过内膜,在周质空间中,前导肽帮助3C正确折叠,蛋白酶生身消化去除前导肽,自发成熟。蛋白酶分泌到胞外成熟后才有活性,通过Superdex-75凝胶过滤层析纯化胞外蛋白酶3C,减少酶液中的杂蛋白,使比活力提高了2倍；活性电泳结果显示,3C有多种具有活性成熟形式,可能以不同的聚体形式存在。基因序列比对结果显示蛋白酶3C从属于M4家族,这与理化性质试验中抑制剂o-P、EDTA和EGTA能够完全抑制3C的酶活性一致；蛋白酶3C的最适酶活温度为40℃,最适pH为7。蛋白酶3C的酶活力受盐浓度的影响较大,低浓度的NaCl对酶活力有促进作用,接近于海水的NaCl浓度对3C的酶活力影响较小；随着盐浓度的提高,酶活性逐渐受到抑制,当NaCl浓度为2.25M时,酶活力下降到25%,说明3C对盐的耐受性不强。3C酶活力能够被大部分的二价金属离子抑制,一价金属离子对其影响很小,只有Mn2+对其活性有微弱的促进作用。