随着全世界工业化进展的加速和人类生态环境的急剧恶化,炎症相关疾病的发病率有全球性增长的趋势,致力于抗炎药物的现代化研究和开发具有较大的现实意义。利用中药对治疗复杂并具有多环节发生机制的炎症疾病的优势,通过阐明疗效确切的传统中药的药效物质基础,从有效成分或有效部位中研究开发中药新药更易于与国际接轨、进入国际市场。黄荆子(Fructus Viticis Negundinis)为马鞭草科牡荆属植物黄荆Vitex negundo L.的干燥成熟果实。性温,味辛、苦;归肺、胃、肝经。具有祛风解表,止咳平喘,理气消食止痛的功效,在民间多用于治疗哮喘、慢性气管炎、胃溃疡、慢性胃炎、类风湿性关节炎等炎症相关疾病。但是,目前对黄荆子的化学成分、药理活性等基础研究严重不足,导致活性部位和活性成分不明确以及没有可行的质量标准,黄荆子药材品种的混乱及质量的参差不齐必将对该生药的使用产生不利的影响。因此,对黄荆子进行活性部位和活性成分的跟踪筛选,阐明其活性物质基础;以活性成分为指标评价其品质,确保药物有效可控,具有较高的可行性和实用性。本课题主要涵盖以下几方面内容:一、活性物质基础研究1以二甲苯致小鼠耳肿胀模型,对黄荆子的80%乙醇提取物及其石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取的各部位进行抗炎活性跟踪筛选,筛选出二氯甲烷部位(DF)和乙酸乙酯部位(AF)为黄荆子中的活性部位。采用柱层析和制备薄层色谱等方法从AF中分离出15个化合物,并应用理化常数测定和光谱(UV, IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR)分析技术鉴定了其中的12个化合物;从DF中分离出70个化合物,鉴定了其中的67个化合物,即共鉴定出79个化合物,其中21个为新化合物(包含9个木脂素,10个二萜和2个三萜),另有30个化合物为首次从黄荆植物中分离鉴定出来。化合物类型主要有木脂素类,二萜、三萜类,黄酮类,甾体类以及一些小分子酚性化合物等。进一步的活性筛选结果表明,以化合物VN-1为代表的苯代萘型木脂素是黄荆子中具有抗炎作用的主要活性成分。从黄荆子中分得的化合物分别为:2采用GC-MS法对黄荆子石油醚部位的亲脂性成分进行分析,从中鉴定出11个化合物。其中主要成分为亚油酸(Linoleic acid),其相对含量在石油醚部位亲脂性成分中占57.22%,饱和及不饱和长链脂肪酸总含量占亲脂性成分的90%以上。二、药效学研究对总提取物、活性部位和单体成分进行二甲苯致小鼠耳肿胀实验、小鼠醋酸扭体实验、小鼠福尔马林实验及体外一氧化氮生成抑制实验和抗氧化实验。结果显示,总提物、DF和AF具有较好的抗炎作用和镇痛作用,对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎性肿胀和化学刺激诱导的小鼠炎性疼痛均有较好的抑制作用;从DF和AF分离得到的单体成分中,以VN-1为代表的一系列苯代萘型木脂素具有较强的体外一氧化氮生成抑制作用和抗氧化活性,以分子结构中含多个羟基的VN-12、VN-50、VN-52和VN-53活性较好,此外,VN-1含量最高且具有显著的体内抗炎和镇痛活性;二萜类化合物VN-38和VN-64亦显示了良好的体外一氧化氮生成抑制活性,其作用与抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达相关。三、国产黄荆的品质评价1对国产黄荆的分布情况进行了初步的调查,结果表明黄荆在我国长江以南地区广泛分布,资源较丰富。从全国9个省市区采集了13个居群样品,对这些不同产区黄荆子药材进行HPLC图谱分析,在以HPLC-UV-DAD法建立不同来源黄荆子药材的HPLC图谱基础上,拟合出共有模式图谱,较全面的反映了国产黄荆子药材的化学特征;并发现不同来源黄荆子药材之间的化学成分有较大差异,结合HPLC图谱显示的化学多样性和各居群黄荆子主成分VN-1(6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3, 4-二氢-2-萘醛)的含量变化差异,可将这13个不同居群的黄荆子分为3个化学型,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。此外,指纹图谱Q型聚类分析结果显示,在结合线水平类间距离等于10时,可将国产黄荆子的13个居群分为三组,与基于化学多样性HPLC图谱人为划分的三个化学型相一致。2建立了同时测定黄荆子药材中4个苯代萘型木脂素类成分的HPLC-UV含量测定方法,并进行了方法学研究。4个对照品分别在3.75-150(VN-1)、3.00-120(VN-2)、1.75-70(VN-5)和3.25-130(VN-12)μg/mL范围内呈良好线性关系,相关系数>0.9998;测定了13个居群黄荆子药材中4个苯代萘型木脂素的含量,结果表明,不同来源的样品4种苯代萘型木脂素的含量有较大的差异。大多数居群药材以VN-1含量较高,结合本研究中VN-1表现出的良好抗炎和抗氧化活性,建议可将其作为黄荆子品质评价的主要指标之一。因此,我们的研究为中药黄荆子的质量控制和新药研发奠定了基础。