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研究背景:椎间盘主要由3个部分组成，即内部胶冻样的髓核组织，外围包绕着髓核的纤维环组织，以及上下两端的软骨终板。椎间盘不但参与脊柱的屈，伸、旋转等运动，还帮助脊柱适应承载负荷，分散应力等。而髓核细胞分泌的细胞外基质对于维持椎间盘生理功能最为重要。髓核细胞能够分泌蛋白聚糖，其中以聚蛋白聚糖(Aggrecan)为主，及各型胶原等细胞外基质的重要成分，蛋白聚糖含量最高，约占髓核干重的50％以上。因此，蛋白聚糖的降解是椎间盘退变的重要因素之一。含有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶(A Disintegrin andMetalloproteinase with Thrombospondin motif，ADAMTS)家族成员中的ADAMTS-4和ADAMTS-5是目前公认最重要的聚蛋白聚糖酶。前期研究已经证实退变椎间盘微环境中的炎症因子如TNF-α，IL-1β等能够刺激髓核细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的高表达，从而降解聚蛋白聚糖，在椎间盘退变的过程具有重要作用。因此对ADAMTS-4和ADAMTS-5的进一步研究，将会使我们对椎间盘退变的分子机制有更进一步的了解。 活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)家族包括NFAT1-4以及NFAT5。其中NFAT1-4主要依靠钙离子相关信号通路激活发挥作用，而NFAT5也被称为渗透压反应元件结合蛋白(osmotic response element bindingprotein，OREBP)或者弹性反应增强子结合蛋白(tonicity-responsive enhancerbinding protein，TonEBP)，该因子是目前哺乳动物唯一已知的应答于细胞外高渗透压环境的转录因子。既往的研究证明钙离子对聚蛋白聚糖合成具有重要作用。而在髓核细胞的研究中，钙离子被证明促进髓核细胞外基质的合成，并且有助于椎间盘承载负荷的能力。众所周知，髓核细胞处于细胞外高渗透压的微环境中。传统观点认为髓核细胞所处高渗环境不利于代谢反应，但是新近的研究表明髓核细胞高渗的环境可能通过活化TonEBP，从而对椎间盘细胞外基质发挥促合成效应。目前，大部分关于钙离子与高渗透压对椎间盘细胞外基质代谢的调控研究主要集中于一些合成代谢因素，而对重要的分解代谢因素的调控却罕有报道。因此，本实验首次研究了钙离子和高渗透压对降解聚蛋白聚糖的关键酶——ADAMTS-4和ADAMTS-5的调控作用，并且检测了NFAT家族因子在该调控中的作用。 目的:研究钙离子和高渗透压对髓核细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5表达的调控作用，探讨钙离子和高渗透压对ADAMTS-4和ADAMTS-5调控过程中可能参与的信号通路(NFAT因子)。 方法:体外培养大鼠髓核细胞，使用10mM NaCl溶液调整培养基渗透压(330osm，450osm，550osm)。随后，使用调整渗透压后的培养基处理髓核细胞24小时。用实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)以及免疫印迹(western blot)方法检测髓核细胞ADAMTS-4，ADAMTS-5 mRNA及蛋白水平表达的变化。构建人PGL3-ADAMTS4，PGL3-ADAMTS5双荧光素酶报告基因质粒，并用该质粒转染髓核细胞以检测高渗透压对ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子水平的调控作用。采用western blot检测高渗透对髓核细胞中TonEBP表达的调控作用;使用JASPAR数据库分析ADAMTS-4，ADAMTS-5启动子片段中可能的NFAT家族结合位点。用TonEBP过表达质粒与ADAMTS-4或ADAMTS-5报告基因质粒共转染髓核细胞，以明确TonEBP信号通路在其中的作用。使用显性负突变(Dominant negative) TonEBP质粒共转染髓核细胞，以进一步明确TonEBP在高渗调控ADAMTS-4与ADAMTS-5表达中的作用。 用ionomycin和PMA一起干预髓核细胞24小时。随后，使用real-time RT-PCR分别检测ADAMTS-4与ADADAMTS-5 mRNA水平的变化，以检测钙离子的作用。转染PGL3-ADAMTS4，PGL3-ADAMTS5双荧光素酶报告基因质粒后，用BAPTA-AM或CsA和FK506干预细胞24小时，以进一步明确钙离子及钙调磷酸酶在启动子水平对ADAMTS-4和ADAMTS-4的调控作用。最后，用NFAF1，2，3，4质粒与ADAMTS-4或ADAMTS-5报告基因质粒共转染髓核细胞，已明确NFAT家族对ADAMTS-4和ADAMTS-5的调控作用。 结果:Real-time RT-PCR与western blot结果显示高渗透压能够抑制髓核细胞中ADAMTS-4，ADAMTS-5 mRNA与蛋白水平的表达。成功构建ADAMTS-4，ADAMTS-5双荧光素酶报告基因质粒，并用JASPAR软件分析ADAMTS-4，ADAMTS-5的启动子片段，发现该ADAMTS-4启动子片段含有2个可能的NFAT家族结合原件，而该ADAMTS-5启动子片段含有3个可能的NFAT家族结合原件。Western blot结果显示高渗透压能够上调髓核细胞中TonEBP的蛋白含量。将DN-TonEBP质粒与ADAMTS-4或ADAMTS-5报告基因质粒共转染髓核细胞，发现DN-TonEBP对ADAMTS-4启动子活性没有明显作用，而DN-TonEBP却阻滞了高渗对ADAMTS-5的抑制作用，同样，TonEBP对ADAMTS-4启动子活性也没有明显作用，而TonEBP对ADAMTS-5显示出强烈的抑制作用。ionomycin和PMA干预细胞后，real-time RT-PCR结果证实细胞内钙离子能够上调ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达。而BAPTA-AM或者CsA和FK506干预细胞后，拮抗了ionomycin和PMA对ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子的激活作用。而NFAT-1，2，3，4转染细胞后，显示NFAT-1对ADAMTS-4启动子活性具有抑制作用，对ADAMTS-5启动子活性具有刺激作用，而NFAT-2与NFAT-3对ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子活性具有刺激作用，NFAT-4对二者启动子活性无明显调控作用。 结论: 1.高渗透压在mRNA水平与蛋白水平均对ADAMTS-4和ADAMTS-5具有抑制作用，并且该抑制作用在髓核组织正常生理渗透压范围内表现出剂量依赖性。 2.高渗透压在转录水平对ADAMTS-4和ADAMTS-5也具有抑制作用，并且对ADAMTS-5的抑制作用是通过TonEBP进行调控的，而对ADAMTS-4的抑制作用却不依赖于TonEBP。 3.钙离子能够刺激ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子活性，并且这一调控过程与钙调磷酸酶有关。 4.ADAMTS-4和ADAMTS-5的启动子区域内可能均存在NFAT家族结合原件，这表明NFAT家族对二者具有一定的调控能力。其中NFAT-1对ADAMTS-4启动子活性具有抑制作用，但是对ADAMTS-5却表现出刺激作用，而NFAT-2与NFAT-3对二者启动子活性均表现出强烈的刺激作用，而NFAT-4对二者启动子均没有明显的调控作用。