中甸刺玫表型变异的分子基础

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中甸刺玫(Rosa praelucens Byhouwer)隶属于蔷薇科蔷薇属小叶组,仅分布在云南省香格里拉县小中甸镇,是一种“极危”的著名高山花卉和重要的月季种质资源,作为异源10倍体植物,中甸刺玫种内存在丰富的表型变异和染色体数量变化,尤其花色分化明显。为了探究多倍化对中甸刺玫表型变异的影响,本研究以种内10种表型为研究对象,并采集每种表型4个不同开放时期的花瓣(每种表型至少采集3个生物学重复样本)和叶片作为实验材料。利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对10种表型3种花色类型进行DNA甲基化模式和水平分析。利用转录组测序技术(RNA-Seq)对4个不同发育阶段的花瓣进行高通量测序,通过GO功能注释与KEGG差异基因富集分析,重点关注了苯丙烷途径和类黄酮途径,筛选出与花青素生物合成相关的关键基因。主要结果如下:1.探索和优化了中甸刺玫MSAP体系,确定了最佳双酶切和连接时间为14h,酶切连接产物和预扩增产物分别稀释20倍和30倍。2.筛选的6对MSAP选择性扩增引物共产生576个位点,570个位点为多态性位点,多态性水平为98.96%。其中甲基化敏感位点(MSL)177个,甲基化多态水平30.73%;非甲基化敏感位点(NML)399个,非甲基化多态水平69.27%;平均每对引物产生30个甲基化敏感位点和66个非甲基化敏感位点。不同花色类型的甲基化水平和模式存在差异,3种花色类型的内侧胞嘧啶甲基化的比例都相对高于半甲基化比例,同种花色类型不同个体之间DNA甲基化水平存在较大差异。中甸刺玫中DNA甲基化与染色体倍性之间没有直接相关性,有的10倍体植株的总甲基化水平高于9倍体和非整倍体,而有的却低于9倍体和非整倍体。3.对中甸刺玫4个不同发育阶段的花瓣进行转录组测序,从不同花色同一时期和同种花色相邻时期两个维度进行比较,共筛选出60927个差异基因。对差异基因进行GO和KEGG富集分析,结果表明:共有22个结构基因参与花青素合成途径,最终筛选出了8个与中甸刺玫花色相关的候选基因。ANS基因表达量相对较高可能是导致桃红型中甸刺玫花瓣中花青苷含量高于白花型和粉白型的关键。由于DFR和FLS存在对于底物的竞争,因此形成了一条生成黄酮醇的途径和一条生成花青素的途径,导致不同含量的黄酮醇和花青素合成,最终生成不同花色类型的中甸刺玫且黄酮醇和花青素含量在花朵不同发育阶段表现出差异。4.对非整倍体(3-1,2n=65)、9倍体(3-2和8-3,2n=9x=63)和10倍体(1-1,2n=10=70)植株的花蕾期阶段进行比较,发现GO功能分类中生物学过程涉及到细胞过程和代谢过程的基因数最多,在细胞组分中富集到膜、膜部分、细胞和细胞部分中的基因数较多,在分子功能类别中参与催化活性和结合的基因数目最多。在KEGG富集分析中主要在苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢和植物激素信号传导代谢通路中表现显著差异。不同倍性植株盛开期8个关键基因表达量比较的结果表明在非整倍体中关键基因PAL1、4CL、CHI1、CHI2、FLS和ANS的表达量均显著高于10倍体和9倍体,UGT在9倍体(3-2)中表达量最高,DFR在9倍体(8-3)中最高,表明很大可能9倍体(3-2)流向了生成黄酮醇的途径,而9倍体(8-3)流向了生成花青素的途径。
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